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Floxata
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
 Inserito il - 28 marzo 2013 : 17:27:28
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Ciao a tutti,
sono una dottoranda al 2° Anno in Biologia e vi scrivo per avere una piccola delucidazione su un problema che sto avendo con il mio progetto. Partiamo dal presupposto che il problema riguarda la genotipizzazione di alcuni topi KO Tessuto specifico creati con la tecnologia Cre-Lox p.
1) Avete idea di cosa può voler dire la terminologia N/A in una PCR? (Not Amplificated?)
2) Se ho due coppie diverse di primer per fare il genptyping, con una coppia riesco a vedere:
- wt 586 bp
-eterozigote 485
- omozigote N/A
con l'altra coppia ho:
-wt 2689
-etero 2300
-omozigote 285
per avere un omozigote per il mio gene di interesse, con la prima coppia in PCR non devo avere alcuna banda e con la seconda la banda a 285. GIUSTO?
Grazie in anticipo a chiunque vorrà rispondermi.. se non si capisce SONO UN PO' DISPERATA [:mmmm
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 28 marzo 2013 : 20:03:29
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1) N/A di solito significa not available. Insomma, la PCR non ha dato alcuna banda per quel campione (poi che sia perchè non ha funzionato o perchè i primer non amplificano nulla in quel caso è un altro discorso).
2) Esatto |
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Floxata
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 28 marzo 2013 : 23:26:31
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Ho ancora altre due domande:
1) se per caso nella seconda PCR (ovvero nella PCR con la seconda coppia di primer)ottengo una banda intorno ai 2300 e una banda a 285...in questo caso avrò un eterozigote?
2) Se nella PCR con i primi due primer ho la banda per l'eterozigote (485), e nella PCR con la seconda coppia di primer ho la banda a 285, in questo caso che cosa è?
Grazie chick80 :)
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2013 : 08:17:17
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Bisognerebbe un attimo capire che regioni sono amplificate dai primers per poterti rispondere...
Non hai una mappa?
Inoltre non ho capito: queste sono PCR per Cre o per il gene per cui vuoi fare il KO? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2013 : 19:27:46
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Sì come dice chick80 sarebbe meglio se tu avessi una mappa e se ci fornissi maggiori dettagli.
Come sta scritto ora non ha molto senso, dato che fino a prova contraria i topi hanno due copie di ciascun cromosoma, se sono eterozigoti avranno un cromosoma WT e uno mutato e quindi con la PCR dovresti vedere due bande, una del WT e una del mutato. Una PCR con una coppia di primer che ti da tre bande diversi con 3 pesi differenti per WT, eterozigote e mut la vedo veramente mooooolto difficile! |
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Floxata
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 02 aprile 2013 : 15:24:49
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Le PCR di cui sto parlando sono per vedere se il gene è stato Knockato o meno, quindi non si tratta di PCR per il CRE.
In realtà non ho nessuna mappa, in quanto è da poco che lavoro con questi modelli murini che sono stati creati in precedenza.
Provo a spiegarmi meglio, se riesco.
Inizialmente ci è stato mandato un modello murino che aveva la sequenza del gene di mio interesse fiancheggiato da due sequenze loxp.
Per genotipizzare questo topo ci sono stati mandati i seguenti primer:
Coppia A: 614/1029
Wt 488
eterozigote 587
omozigote N/A
Coppia B: 465/ 1029
WT: 2487
eterozigote:2632
Omozigote: 285
L'omozigote(CHE CHIAMERò FLOX FLOX) è stato incrociato con un modello murino che esprime la ricombinasi CRE sotto un promotore tessuto specifico, per ottenere il Knock out tessuto specifico.
Adesso per capire se ho un knockout o meno dalla genotipizzazione devo:
- assicurarmi che sia CRE
- assicurarmi che sia FLOX FLOX, OVVERO omozigote.
Come faccio?
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 02 aprile 2013 : 20:34:34
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So come si fanno i topi cre-lox, ma quello che hai scritto sulla genotipizzazione non ha alcun senso.
Il topo ha due copie di ciascun cromosoma e qua non ci piove, quindi se vai ad amplificare la regione floxed avrai una banda di una certa lunghezza per il wt una più grande per il floxed. Ora il risultato è questo:
- omozigote WT: banda più piccola
- omozigote flox: banda più grande
- eterozigote entrambe le bande
Con le coppie di primer che hai indicato tu evidentemente vai a vedere se c'è stata l'excisione.
Si capisce dalla grandezza della bande che ti si dovrebbero amplificare.
Ora scusa ma sono un po' di fretta e devo scappare, comunque ho capito a cosa si riferiscono quelle bande, più tardi ti spiego meglio. |
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Floxata
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 02 aprile 2013 : 22:42:58
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Grazie GFpina per la tua risposta, anche io credo che non abbiano alcun senso, vorrei tanto capire come interpretare le genotipizzazioni...edè per questo motivo che ho scritto su questo forum. Se mi aiuti a capire te ne sarei tanto grata!!!! :)
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2013 : 00:24:26
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Allora come ti dicevo quei primers servono per vedere se il gene floxato è stato exciso.
I primers sono disposti in questo modo:
la coppia A è disposta ai lati di un sito flox, nel WT amplifica una banda più piccola mentre nel Floxed una banda più grande perchè c'è in mezzo il sito flox. Se il frammento floxato viene exciso da Cre, uno dei due primers non si appaia più e non hai amplificazione.
Quindi per la coppia A hai:- floxed 586 bp
- wt 485 bp
- deleto N/A
La coppia B è disposta ai due lati dei siti flox, nel WT amplifica un pezzo abbastanza grosso, nel floxed un pezzo più grande perchè contene i due siti flox, mentre se avviene l'excisione nel floxed avrai un frammento molto piccolo.
Gli amplificati della coppia B sono:- floxed 2689 bp
- wt 2300 bp
- deleto 285 bp
Se hai un eterozigote comunque vedi due bande, quella del WT e quella del floxato (exciso o non exciso).
Le scritte wt, eterozigote e omozigote che ci sono in quello che hai scritto tu non so da dove vengono, ma evidentemente sono sbagliate.
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Floxata
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2013 : 11:11:51
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| Grazie GFPina...un'ultima domanda, ma se ho un omozigote per flox, che quindi viene exciso da CRE, secondo quanto ho scritto (ammettendo che sia corretto) che bande dovrei vedere? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2013 : 16:44:51
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Non era chiaro quello che ho scritto?
Se hai un omozigote Flox e Cre+ e Cre taglia (non è detto che lo faccia!) avrai la delezione su entrambi i cromosomi, quindi:
PCR A: nessuna banda
PCR B: banda da 285bp |
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Floxata
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2013 : 17:08:31
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| Scusami GFpina, forse non avevo capito io!!!! Grazie!!! |
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Floxata
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2013 : 18:08:46
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Ciao GFpina, scusami se continuo a farti domande, ma ho ancora qualche dubbio.
1) Perchè ho lo stesso reverse per entrambe le coppie di Primer?
2) Se ho un Topo in cui dal genotyping risulta CRE,
dalla PCR A ho la banda a 587 (FLOXED)
dalla PCR B ho la banda a 285 ( deleto)
Come lo interpreto?
Grazie :) |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 aprile 2013 : 15:52:50
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Citazione:
Messaggio inserito da Floxata
1) Perchè ho lo stesso reverse per entrambe le coppie di Primer?
Questo da dove lo deduci?
Citazione:
Messaggio inserito da Floxata
2) Se ho un Topo in cui dal genotyping risulta CRE,
dalla PCR A ho la banda a 587 (FLOXED)
dalla PCR B ho la banda a 285 ( deleto)
Come lo interpreto?
Bah probabilmente è topo Flox in cui la delezione non è completa, dovresti anche vedere la banda da 2689 nella seconda PCR, ma ovviamente il frammento più piccolo è favorito quindi può anche essere che sia molto debole o che tu non la veda affatto.
Certo che però darti una mano alla cieca è un po' difficile, dovresti sentire chi ti ha dato primers e topi e farti spiegare bene come funzionano, o almeno farti dare le sequenze. |
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Floxata
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 05 aprile 2013 : 16:55:49
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Per quanto riguarda il reverse ho le sequenze dei primer per questo so che ho lo stesso reverse. Per quanto riguarda i topi ci sono stati mandati 4 anni fa con i primer per il genotyping. Il problema è che a quanto comprendo io dalle genotipizzazioni per il KO ( Valutando IL CRE e le due coppie di primer), credo di non aver mai avuto un topo che sia KO per il mio gene di interesse.
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Floxata
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2013 : 11:03:56
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Ciao GFPina,
scusami se ti disturbo, ti avevo scritto tempo fa per delle delucidazioni sul sistema Cre-Loxp per la generazione di topi KO tessuto specifici. Ho nuovamente dei dubbi.
Ti spiego io ho un VillinCRE e voglio creare un KO intestinale per il gene X.
Ho i topi X flox/flox e li ho incrociati con il vILLINCRE. Adesso se volessi genotipizzare dei topi risultanti da questo incrocio. Ho TRE coppie di primer:
A- mi dice se il topo è un VillinCRE
B- mi dice se è flox/wt per il mio gene
C-mi dice se si è verificata l'excisione.
Adesso se utilizzo per la PCR il DNA-TAIL posso vedere secondo te, se si è verificata l'excisione? O essendo tessuto specifico potrò capirlo solo utilizzando il tessuto stesso cioè l'intestino?
Grazie per il tuo aiuto,
Annalisa |
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Genotyping topi
Didattica
