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PIM3
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 Inserito il - 08 giugno 2013 : 19:27:13
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Salve scienziati!
Qaulcuno saprebbe spiegarmi il principio e la modalità di svolgimento di un Kinase assay? Quali sono le modalità e i dispositivi impiegati.
Sono disperata! Un aiuto o indirizzamento di qualsiasi tipo sarebbe fantastico!
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2013 : 14:45:07
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| cosa esattamente non ti è chiaro? Il principio dell'assay è che hai una chinasi (o proteina da testare come attività chinasica), un substrato (o proteina da testare come substrato di fosforilazione), una fonte di energia (ATP). Si settano le condizioni di reazione (in genere cominci da una ricerca su pubmed)e poi valuti la fosforilazione sia per autoradiografia (se usi ATP caldo) sia per western blot con anti p-Tyr/Ser/Thr (meno frequente, si fa quando usi solo ATP freddo). |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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PIM3
Nuovo Arrivato
19 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2013 : 14:54:34
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Grazie mille!
Il principio credo di averlo afferrato, adesso sono le modalità e i vari passaggi che mi risultano ostici.
se potessi spiegarmi passo passo cosa bisogna fare e cosa bisogna aggiungere, te ne sarei grata per tutta la vita. (sono disperata, qualsiasi aiuto è ben accetto)
infatti, sono iscritta al III anno di Biologia e, per la prima volta, sono entrata in un laboratorio vero per le 300 ore di tirocinio della tesi.
Fin qui tutto rose e fiori, l'unico problema è che mi hanno appioppato ad una tutor di nazionalità russa (che parla solo russo e ing) caratterizzata da un metodo educativo GULAG e che il primo giorno mi ha messo a fare il Knase Assay (io ovviamento non ci ho capito niente!!!!!)
Ancora ringraziandoti,
Sarah
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2013 : 16:51:56
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allora, calma e sangue freddo, che la tutor sia russa, tedesca o marziana, poco importa! E' un suo dovere spiegarti le cose senza pretendere che tu sia nato "imparato". Se lei non ti fa vedere o non ti spiega i passaggi dell'assay, come può pretendere che tu lo esegua da solo?
E' un assay già settato o parti dall'inizio? che cosa ti ha detto di fare? lavori con proteine ricombinanti o immunoprecipitate? usi ATP caldo?
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PIM3
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19 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2013 : 12:36:29
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Innanzi tutto, grazie per il supporto!
Io ho cominciato il tirocinio qualche settimana fa ma ho dovuto interrompere dopo qualche giorno perchè ho un esame (Biologia Molecolare appunto!). La tutor mi ha fatto fare il primo giorno un kinase assay (lei mi chiedeva di passargli le cose e io osservavo con occhio attento ma ignorando completamente il senso e la finalità delle Sue azioni). Mi ha speigato pochissimo e solo in generale. l'ultimo giorno salutandomi mi ha detto di prepararmi perch quando tornerò (il 27 il Kinase assay lo farò io).
Mi manca totalmente una visione organica e olistica del tutto, nonchè mi manca la comprensione e la conoscenza e familiarità con i passaggi e i substrati.
Per quel che mi ricordo, aggiungevamo l'ATP in alcuni campini e basta. per quanto riguarda le proteine credo siano state sintetizzate tramite plasmidi.
Se hai tempo e voglia, mi aiuterebbe molto sapere quali sono i passaggi generali e i "reagenti" (se cosi si chiamano) che vanno aggiuti per creare l'ambiente adatto.
Grazie mille in anticipo del supporto!!!
sarah
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2013 : 16:49:29
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gia se cerchi qualcosa su pubmed, riesci a trovare parecchio materiale. Giusto per esempio: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406331
l'aggiunta di ATP in alcuni campioni ma non in altri potrebbe essere semplicemente da controllo, cioè, come controllo della reazione avvenuta in vitro, si mette un campione in assenza di ATP nel quale, se tutto va bene, non dovrebbe avvenire alcuna fosforilazione.
Le proteine "sintetizzate da plasmidi" non mi dicono molto. Sia le proteine per mammalian expression che purificate dopo bacterial expression sono prodotte a partire da plasmidi, da quello che capisco io mi sembra che siano proteine ricombinanti purificate, ma potrei sbagliarmi.
I "reagenti" non sono alche che:
-la tua chinasi
-il tuo substrato
-la fonte energetica
-il buffer di reazione che contiene cofattori e/o inibitori della degradazione proteica o della de-fosforilazione
Ora, quello che vorrei che tu veramente capissi è che non esiste un kinase assay universale. Ognuno adatta un protocollo generale alle proprie esigenze e alle proprie proteine.
Ti potrei dire che i miei assay sono fatti con 480ng di enzima ed 1ug di substrato, che la reazione dura 15 minuti a 37°C in buffer hepes, MgCl2, NaF, DTT e Na3VO4...ma questo a te non dice nulla! Sicuramente le condizioni che devi usare tu sono diverse dalle mie.
In generale diciamo che un assay viene fatto co-incubando una proteina di cui vuoi testare l'attività chinasica ed un'altra proteina di cui testi la modificazione (o più proteine in entrambi i casi). L'incubazione delle proteine richiede un ambiente favorevole alla reazione, cioè un buffer adatto che ti setti in base alle proteine o che trovi su qualche lavoro dove si usano le tue proteine. La reazione non avviene se non usi una fonte di energia, ovvero ATP. Su questo non vado avanti perchè io uso solo ATP freddo ma nella maggior parte dei casi si usa anche ATP caldo. La durata della reazione viene valutata in fase di setting, ad esempio io ho visto che già dopo 15 minuti la mia chinasi fosforilava tutto il substrato e dopo 30' ero a saturazione.
Per tutti i motivi che ti ho detto (e non perchè io non sia disposta a farti capire di cosa stiamo parlando), penso che la cosa migliore sia che tu dica alla tua tutor che sei entusiasta all'idea di allestire l'assay, che ti sono chiari i principi (almeno spero!), am che non puoi farlo fino a quando lei non ti darà tutte le informazioni necessarie per l'esperimento.
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PIM3
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19 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2013 : 16:52:01
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Grazie infinite Iside,
mi hai salvato la vita!
ma come fai a sapere tutte queste cose? |
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