| Autore |
Discussione |
|
|
Condrio-mito
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
 Inserito il - 30 giugno 2013 : 11:49:25
|
Ciao a tutti! Potreste gentilmente aiutarmi a risolvere un quesito?!! Ho letto che con il metodo EMSA posso determinare l'affinità prteina- dna sapendo entrambe le concentrazioni iniziali di dna e proteina e la stechiometria della reazione. Come si fa?!! Vi ringrazio molto in anticipo
|
|
|
|
|
Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2013 : 13:02:43
|
Ciao visto che mi avevi mandato un MP ti rispondo qui così sentiamo anche altri!
Io non ho mai fatto un EMSA nè mai studiata la procedura nel dettaglio ma io farei così: l'affinità di legame proteina-DNA la possiamo associare alla rispettiva costante di dissociazione (Kd) definita come:
[Proteina] [DNA]
Kd = ------------------------
[Complesso Proteina-DNA]
Conoscendo sia la concentrazione di proteina che di DNA ci resta da determinare la concentrazione del complesso proteina-DNA. Questa può essere determinata sperimentalmente ad esempio con un EMSA valutando l'intensità del segnale sul gel rispetto ad uno standard. A questo punto possiamo calcolare algebricamente il valore della Kd.
Che ne pensate di questa grezza strategia? |
|
 |
|
|
Condrio-mito
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2013 : 15:50:08
|
Ti ringrazio della risposta! ti avevo mandato un MP nel caso non ti fossi accorto della discussione pubblica Nel metodo EMSA il DNA viene marcato radioattivamente quindi con la rilevazione possiamo determinare solo la concentrazione del DNA ma non della proteina...quindi cmq non posso sapere quanta proteina si lega al DNA...giusto?... Io avevo pensato che si poteva aumentare la concentrazione di DNA fino ad avere la saturazione del legame con la proteina...che ne pensi? |
|
|
|
Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2013 : 16:54:39
|
Però conoscendo la stechiometria della reazione puoi correlare la concentrazione del DNA legato nel complesso con quella della proteina nella stessa forma. Ovviamente considerando sul gel l'intensità della banda che ha subito lo "shift", cioè quella che appartiene al complesso proteina-DNA.
Puoi spiegare meglio cosa intendi con l'aumentare la concentrazione di DNA fino a saturazione? Cioè cosa faresti praticamente? |
|
|
|
|
Condrio-mito
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2013 : 19:08:38
|
intendevo dire che si potrebbe aggiungere DNA marcato in eccesso fino ad avere la nostra quantità di proteina del tutto legata ed ottenere così una concentrazione di dna marcato che corrisponde alla concentrazione del complesso dna-proteina.Fai come se non te l'ho scritto
Probabilmente hai ragione tu, la tua idea mi sembra molto più lineare. Quindi con il tuo metodo, una volta che sappiamo la concentrazione del DNA legato ci calcoliamo la concentrazione della proteina legata grazie alla stechiometria della reazione e poi per sapere la concentrazione del complesso basta fare la somma delle due concentrazioni? |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 01 luglio 2013 : 17:53:44
|
Sì più o meno è come hai detto tu Geeko.
In realtà precisamente quello che si fa è questo:
si preparano vari campioni con una quantità costante di DNA e una quantità crescente di proteina, si seminano tutti su gel e il risultato sarà che all'aumentare della quantità della proteina aumenterà la banda "ritardata", cioè quella del complesso DNA-Proteina mentre diminuirà la banda del DNA libero.
(ovviamente su gel vedi entrambe le bande!)
A questo punto puoi valutare per ogni campione la "frazione di DNA legato", fare un bel grafico con tutti i punti con in ascisse la concentrazione di proteina e in ordinate la % di DNA legato. Poi utilizzi l'equazione di Hill per ricavare la costante di affinità. |
|
|
|
Liocla
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2013 : 11:00:40
|
Sembrerò banale...ma andiamo per gradi...
innanzitutto il saggio EMSA si basa sul fatto che un frammento di DNA, se sottoposto a gel elettroforesi, ha una velocità di migrazione maggiore rispetto allo stesso frammento complessato a una proteina.
I frammenti di DNA da utilizzare per il saggio vengono "marcati", ossia forniti di un elemento che ne consenta la visualizzazione: per esempio, una PCR con un primer fluorescente (con un fluoroforo legato al 5') consente in maniera molto semplice di ottenere una sonda marcata.
A questo punto, la sonda di DNA marcata e la proteina vengono sottoposte a reazione di Binding: semplicemente vengono posti insieme in provetta, in presenza di un buffer opportuno che ne consenta l'interazione. L'aspetto importante di qst reazione di Binding è che si allestiscono più reazioni modificando i rapporti DNA\proteina: per una data e fissa quantità di proteina, si utilizzano diverse diluizioni di proteina.
Le reazioni di Binding vengono sottoposte a corsa elettroforetica e si valuta l'eventuale presenza di ritardo elettroforetico associato al legame della proteina al DNA.
A questo punto, quindi sei ingrado di dire se la proteina lega o meno il DNA!
L'affinità di legame è altra storia....
bisogna misurare la cinetica di dissociazione del complesso DNA/proteina utilizzando un eccesso dello stesso DNA però non marcato.
cerco di spiegarmi nel modo più semplice possibile....
Si fa innanzitutto avvenire la reazione di Binding tra il DNAmarcato e la proteina: si forma il complesso DNA/proteina. Al termine della reazione di Binding, si aggiunge un laaargo eccesso di DNA non marcato (tempo 0) e si fa proseguire la reazione , effettuando prelievi ogni x tempo (tempo 1 sec, tempo 5 sec, etc...).
Il principio di fondo è che man mano che il complesso si dissocerà, la proteina tenderà a legarsi di nuovo al DNA, ma questa volta al DNA non marcato poichè in largo eccesso!!
Tutti i prelievi (t0, t1, t5, tetc...) vengo caricati su gel.....e qui viene il bello....
i calcoli sono complessi ma ti dico che bisogna allestire un sistema di assi cartesiani ponendo sull'asse x il tempo e sull'asse y il logaritmo naturale del rapporto tra la concentrazione del complesso al tempo t e la concentrazione del complesso al tempo 0. La retta che si ottiene avrà un coefficiente angolare... tale coefficiente è proprio la costante di dissociazione del complesso!!!
A questo punto, dalla costante di dissociazione si può calcore l'emivita del complesso DNA/proteina, cioè si può valutare la vita media del suddetto complesso, che è indice dell'affinità tra i componenti in gioco!
Forse prolissa...ma spero di esserti stata utile!
Buon ritardo!  |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2013 : 17:30:22
|
Beh ma non è che bisogna "per forza" utilizzare il metodo competitivo, si può fare benissimo anche con il metodo diretto, puoi utilizzare direttamente la proteina e la sonda marcata usando quantità crescenti di sonda e andando a vedere quanta se ne lega.
Sicuramente il metodo competitivo ha dei vantaggi in alcuni casi, ad es. se devi valutare il legame di diversi frammenti di DNA/RNA (ad es. mutanti), terrai solo una specie marcata e poi farai competere le altre non marcate, in questo modo non devi farti la marcatura di tutte le sonde.
Comunque i metodi possono essere diversi, qua ad es. ne descrivono 4:
http://www.jbc.org/content/277/19/16705.long |
|
|
|
Liocla
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 22 luglio 2013 : 10:50:44
|
Certo certo... ci sono diverse modalità, che si possono tranquillamente ritrovare su un qualsiasi libro di tecniche...
ovviamente ho dato info sul metodo che utilizzo normalmente...
 |
|
|
| |
Discussione |
|
Come si calcola l'affinità proteina-DNA con il metodo EMSA?
Guide tools online
