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nannuto
Nuovo Arrivato
33 Messaggi |
 Inserito il - 18 novembre 2013 : 17:18:45
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Ciao a tutti, per chi di voi utilizza PCR e/o RT-PCR volevo chiedere se è possibile estrarre RNA da un numero di cellule in adesione pari o inferiore a 500000. E se si quale kit di estrazione avete usato e quale è stata la resa in termini di mg di RNA ottenuto. Grazie 
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2013 : 17:39:26
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| Si può sicuramente fare. Noi facciamo single cell RT-PCR, non so esattamente che kit usiamo (non me ne occupo io personalmente) ma posso chiedere. |
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Miki_
Nuovo Arrivato
29 Messaggi |
Inserito il - 21 novembre 2013 : 16:13:46
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fatto con 50.000-100.000. banalmente col tri-reagent della sigma (100ul/campione). chiaramente è meglio estrarlo in giornata e con tutti i sacri crismi del caso per evitare che il poco che c'è si degradi. puoi aggiungere un po' di glicogeno prima di mettere l'isopropanolo, aiuta la precipitazione e rende il pellet più bianco, quindi più visibile. risospendi in massimo 20ul di acqua rnasi/dnasi free.
per la retro va bene uno dei soliti enzimi...il revert aid della fermentas o la mlv di sigma van benone. ovviamente retrostrascrivi il più possibile (ovvero sostituisci tutta l'acqua con l'rna).
so che esistono anche delle colonne fatte apposta per i campioni poveri...la qiagen fa pena, punterei alla macherey nagel |
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nannuto
Nuovo Arrivato
33 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2013 : 09:07:43
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| grazie mille! siete stati utilissimi!!! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2013 : 01:01:30
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Citazione:
Messaggio inserito da Miki_
...la qiagen fa pena, punterei alla macherey nagel
 Strano io direi esattamente il contrario!!! |
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Miki_
Nuovo Arrivato
29 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2013 : 16:00:55
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bho, a me con le colonnine rosa della qiagen veniva peggio che ad estrarlo a mano col metodo sacchi (e l'ho fatto correre su gel, non è lo spettrofotometro impazzito)
poi vabbè, la rappresentante di zona a milano non è affrontabile, quindi se posso li evito a prescindere |
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numero minimo cellule per PCR e RT-PCR
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