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apocalipse
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: napoli
1 Messaggi |
 Inserito il - 21 febbraio 2007 : 19:04:46
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ciao!ho un problema...devo usare una membrana pvdf per un blotting e volevo sapere
1)i poli del blotting sono sempre uguali?cioè le proteine vanno da negativo a positivo?
2)posso colorare con pauncea per vedere il trasferimento?
e poi se avete qualche raccomandazione in particolare fatemi sapere....
grazie a tutti....
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se un esperimento funziona..qualcosa non ha funzionato |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2007 : 19:24:27
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si, sono membrane che mantengono la stessa porosità di quelle di nitrocellulosa e le puoi tranquillamente colorare con ponceau...l'unica cosa, almeno così mi pare, è che devono essere immerse prima dell'uso in una soluzione contente metanolo. non so dirti di più, magari può rispondere qualcuno più esperto di me in membrane PDVF, ma mi sembra di aver letto questa cosa.
per quanto riguarda la migrazione delel proteine, quella non dipende dalla membrana ma dal campo elettrico applicato e dalle proteine: con l'uso del sample buffer le tue proteine migreranno sempre da negativo a positivo, a prescindere dalla membrana.
devi lavorare come se stessi usando una membrana di nitrocellulosa.
ma devi fare un western?...io in genere consiglio sempre di non colorare mai le membrane con ponceau...contiene acido acetico che può agire sulle tue proteine (che, ad esempio, si possono defosforilare e se cerchi una fosfoproteina sono guai!!!)...se fai l'occhio puoi controllare che il trasferimento sia avvenuto anche mettendo la membrana in controluce:si vedono le bande!!! |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2007 : 11:09:38
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Si l'unica differenza e che la membrana di PVDF va attivata immergendola qualche secondo in metanolo e poi trasferendola subito nel tampone di trasferimento, come dice Anyra non bisogna farla asciugare!
Riguardo al tampone di trasferimento io lo uso con SDS e non ho mai avuto problemi (perchè dici di usarlo senza SDS Anyra?) io uso TGS (Tris Glicina SDS) con 20% di Metanolo.
Per il Ponceau (si scrive così) a me non viene (anche se nel vecchio laboratorio mi veniva? Boh non ho mai capito il perchè!), ma ovviamo utilizzando uno standard colorato che si vede sulla membrana dopo il trasferimento, e casomai dopo aver finito tutto il procedimanto del WB coloro la membrana con Comassie!
Per la defosforilazione... non ci avevo mai pensato, ne ho imparata una nuova!
Ciao |
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2007 : 11:39:42
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Non uso SDS perchè nel protocollo del trasferimento della PVDF che ho non lo mette.
e poi il tamp di trasferimento veloce che uso (o meglio usavo ora sono Biologa molecolare con molto rimpianto per la biochimica) non era previsto.
Tutto qua |
Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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byo_gio
Nuovo Arrivato
Prov.: MI
Città: Milano
66 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2007 : 23:06:34
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scusate chi l'ha detto che non si possono reidratare???
non e' il massimo ma si puo' fare benissimo... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 23 marzo 2007 : 12:28:27
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Citazione:
Messaggio inserito da byo_gio
scusate chi l'ha detto che non si possono reidratare???
non e' il massimo ma si puo' fare benissimo...
Hai perfettamante ragione byo_gio!!! 
Si possono anche disidratare per conservarle e poi reidratarle e processarle normalmente. Il consiglio prima di reidratarle è di riimmergele in metanolo!
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membrane pvdf
Didattica e Relazioni
