| Autore |
Discussione |
|
|
biomol
Nuovo Arrivato
65 Messaggi |
 Inserito il - 21 febbraio 2007 : 19:38:13
|
|
ciao....dubbio...ma il panceau può davveroo defosforilare una proteina dopo blotting?io non ci ho mai pensato!
|
|
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2007 : 20:09:14
|
come dicevo nella precedente discussione, io non coloro mai con ponceau...la colorazione delle proteine avviene perchè il colorante vi si lega e, anche con i risciacqui, ci sarà sempre una quota minima di ponceau legata alle proteine. il fatto della defosforilazione mi è stato ripetuto più e più volte e quando ho chiesto spiegazioni mi hanno detto che i gruppi fosfato su una proteina sono facilmente persi, sia con la colorazione col ponceau che con lo stripping della membrana. questo è il motivo per cui si blotta sempre prima per la fosfoproteina e poi per la proteina totale. di più nin so... |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
|
 |
|
|
valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2007 : 10:23:47
|
Mmmm.. interessante!
Letto questo messaggio pensavo di aver risolto tutti i miei problemi MA il tutto e' durato 10 microsecondi...
Se voglio discriminare la proteina fosforilata da quella normale solamente in base alla migrazione sul gel, non mi interessa se la proteina incriminata perde o meno il fosfato dopo la migrazione, giusto?
La sua posizione sul gel rimarra' la stessa di prima della colorazione Ponceau, cioe' sara' comunque influenzata dal fosfato...
Certo tutto cambia se voglio usare un anticorpo contro la proteina fosforilata!
Scusate, riflettevo a voce alta...
Grassie |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2007 : 10:45:56
|
| Non riesci di solito a discriminare fosforilata da defosforilata solo tramite migrazione di solito. In generale si usano due diversi anticorpi. |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2007 : 10:52:20
|
Eh lo so, ma per certe proteine si vede una grossa differenza tra le due forme...
Basta essere un pochino fortunati...  |
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2007 : 14:26:25
|
rispondendo a chick:la fosforilazione di una proteina in genere non ne altera mai il PM al punto tale da far migrare meno la proteina rispetto alla sua forma non fosforilata. quindi hai ragione. soprattutto se consideri che per molte proteine attivazione=fosforilazione, è importante discriminare la forma fosforilata dalla forma totale.
rispondendo a valia invece: certo che ti interessa se la proteina perde il fosfato dopo la migrazione perchè tu dovresti usare un Ab che sia diretto contro la forma fosforilata (ad esempio p-EGFR oppure, più, genericamente, p-Tyr, p-Ser, p-Thr...). se dopo la migrazione perdi i gruppi fosfato, a cosa si lega l'Ab? questo discorso vale soprattutto x quegli Ab che riconoscono come epitopo un residuo fosforilato...
per quanto riguarda le differenze di migrazione tra le due forme, penso che dipenda molto dalla concentrazione del gel...un gel al 12% non ti fa discriminare molto. tu in genere a che % lo usi?
questa discussione cmq è interessantissima |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
|
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2007 : 14:28:24
|
uh, scusa Valia, non avevo letto la seconda parte del tuo messaggioquando dici "Certo tutto cambia se voglio usare un anticorpo contro la proteina fosforilata". alla fine abbiamo detto la stessa cosa 
|
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
|
|
|
|
valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2007 : 14:41:00
|
Mmm, e' vero che un gruppo fosfato altera in maniera lieve il PM, ma molte volte anche usando un gel 10% si puo' notare uno shift dovuto a qualcosa tipo la redistribuzione delle cariche della proteina causata dal gruppo P!
Ci sono molti esempi in letteratura!
Il problema e' che questo non succede a tutte le proteine, ufff... dipendera' dal numero di residui fosforilati e dalla loro posizione...
|
|
|
| |
Discussione |
|
panceau
Didattica e Relazioni
