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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
 Inserito il - 23 febbraio 2007 : 17:50:07
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Mi serve l'aiuto di persone esperte di western.
Solitamente metto ad ibridare la membrana per 1h sia con l'anticorpo 1° che 2° (entrambi alle opportune diluizioni in latte con TBS+tween) nelle vaschettine e sempre lì faccio i lavaggi con TBS+Tween (3 da 10 minuti) sia dopo l'ibridazione con il 1° che con il 2° per rimuovere l'eccesso di anticorpo. Dopo aver sviluppato la lastra il risultato è sempre più che soddisfacente.
Questa volta devo dividere la membrana in diverse parti per ibridare le lanes diverse con anticorpi diversi, voglio mettere i vari pezzi di membrana in falcon da 15mL, mi consigliate di cambiare i tempi di ibridazione con il 1° ed il 2°, oppure i tempi di lavaggio? Infatti penso che in una falcon il contatto della membrana con le soluzioni è maggiore e quindi ho paura che i lavaggi anzichè togliere gli eccessi di anticorpo rimuovano tutto l'anticorpo.
Help me please!!
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MariBi
Utente Junior
170 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2007 : 18:02:36
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Il tempo di ibridazione del 1o anticorpo è sempre lungo, di solito O.N., per il 2o anticorpo il tempo è di un'ora. Io uso gli stessi tempi, sia per l'anticorpo che per i lavaggi, anche quando metto le membrane nelle falcon.
Se l'anticorpo si è legato è molto difficile che venga rimosso da un lavaggio blando e delicato. Questo è ciò che sento di dirti.  |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2007 : 18:44:33
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ciao.
io spesso ho lasciato le membrane in falcon (da 50ml però), facendo un'ibridazione con l'AbI O.N. e rigorosamente in agitazione a 4°C.
mi sorprendono i tuoi tempi di ibridazione con il primario così brevi (con il II faccio anche io ibridazione di un'ora, anche di 45 minuti se ho fretta), ma se i tuoi risultati sono buoni allora non cambiare.
concordo con maribi quando dice che i lavaggi non rimuovono l'anticorpo. quando ho lasciato le membrane in falcon non ho fatto nessuna variazione con i tempi di ibridazione ne' con i tempi di lavaggio (io faccio 1 da 10' e 3 da 5').
ciao!
ps: perchè hai postato una domanda di biochimica nella sezione del molecolare? |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2007 : 18:49:56
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Ragazze grazie per le risposte.
Stavo controllando un msg inserito in questa sezione ed ho inserito erroneamente questo messaggio in questa sezione, me lo potete trasferire in biochimica? |
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atreliu
Amministratore
Prov.: Milano
Città: Milano
2484 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2007 : 18:54:14
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Citazione:
Messaggio inserito da Crick82
me lo potete trasferire in biochimica?
Fatto  |
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