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BioLog88
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34 Messaggi |
 Inserito il - 13 maggio 2014 : 18:03:08
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Ciao a tutti,
chiedo un aiuto a voi riguardo un problema ricorrente in real time: sto facendo la tesi magistrale e sto imparando ad eseguire la real time in modo corretto, ma ultimamente un problema mi perseguita. Quando carico la real time e successivamente la analizzo, le triplette (i tre pozzetti in cui carico il cDNA di ogni campione) sono molto distanti l'una dall'altra. Il che non va bene. Mi è stato detto essere un problema di "spipettamento" del cDNA però non so...qualche suggerimento?Chiunque sappia darmi un aiuto lo ringrazio infinitamente.
Ciao a tutti e grazie
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Città: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2014 : 16:57:04
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L'uniformità dei replicati di PCR può essere migliorata in vari modi e a seconda dei casi si può:
- mescolare il campione contenente il DNA molto bene (uso di agitatori, uso del vortex prima dell'utilizzo)
- preparazione di una mini mix contenete Mastermix e DNA in proporzioni maggiori (per esempio per 3,5 pozzetti), vortexata, spinnata in centrifuga e aliquotati i 3 pozzetti
- uso di pipettatrici automatiche
- il pipettamento corretto si raggiunge con la pratica e il corretto uso delle pipette (manuale di istruzione e/o training con qualcuno più esperto accanto) |
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BioLog88
Nuovo Arrivato
34 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2014 : 17:12:41
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Grazie mille, gentilissimo. Al di la della pratica ed esperienza che io non ho ancora, le altre cose le metterò subito in pratica.
Ti chiedo solo un chiarimento: la mini mix,cosa intendi? la mix la preparo in eccesso, nel senso che la calcolo tenendo conto dell'acqua che tratto come campione piu un eccesso...intendi questo?avere la mix non giusta per 3 pozzetti, ma per piu pozzetti?
Le pipettatrici automatiche ahime non le abbiamo in lab...
per il resto ti ringrazio, proverò sicuramente. |
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Città: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2014 : 18:24:37
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Non so in particolare modo che esperimento devi fare, ma si, ad esempio puoi preparare la tua "ricetta" con gli ingredienti, escluso il DNA, per tutti i pozzetti che andranno in piastra; suddividerai la mix in aliquote separate per 3,5 pozzetti, a queste aggiungerai i vari DNA nelle proporzioni di 3,5 pozzetti. Cosi, dopo il mescolamento, potrai caricare i pozzetti riducendo al minimo l'errore di carico che si introduce caricando il DNA per 3 volte separatamente.
Spero abbia capito il concetto per poterlo applicare al tuo esperimento. Ciao.
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BioLog88
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34 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2014 : 21:14:16
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| Ho capito, grazie mille. In pratica il mio esperimento riguarda il trattamento di cell staminali ASC in modo che differenzino in condrociti. Poi in real time alle 72 ore, 7 e 15 gg devo andare ad analizzare geni precoci e tardivi. Comunque ti ringrazio, proverò sicuramente. Ciao |
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Miki_
Nuovo Arrivato
29 Messaggi |
Inserito il - 22 maggio 2014 : 14:13:57
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| vortexa il cDNA e poi spinnalo (sia la madre che eventuali diluizioni), migliora le cose di molto :) |
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BioLog88
Nuovo Arrivato
34 Messaggi |
Inserito il - 23 maggio 2014 : 10:40:43
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| Grazie Miki. Proverò tutti i vostri consigli,non posso permettermi di avere altre triplette diverse. grazie mille!!!! |
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Problema triplette Real time
Didattica e Relazioni
