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Matilde G
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 27 agosto 2014 : 14:39:00
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Salve a tutti, l'argomento è già stato trattato ampiamente qui sul forum e ho letto le discussioni passate con molta attenzione ma comunque mi restano dei dubbi che con il solo materiale datomi dal docente e con gli approfondimenti letti qui sul forum non riesco a chiarirmi.
Specifico a scanso di equivoci che essendo un esame di laboratorio di biologia molecolare mi viene richiesto di disegnare manualmente i primer senza nessun ausilio di software.
Le regole per il disegno le ho comprese e le ho chiare nella mia testa (evitare: motivi ripetuti, sequenze che possano formare strutture secondarie, complementarietà tra 3'-ends; fare in modo che via sia ugual contenuto di ciascun nucleotide, estremità 3' possibilmente con CG in modo da assicurare un attaccamento piu saldo del primer..ecc).
Purtroppo non ho esercizi da poter allegare in quanto il docente tra un esame e l'altro li ricicla quindi non ce li lascia, ma cercherò di esporvi al meglio i miei dubbi in modo tale da non creare uleriore confusione.
Ad esempio in un esercizio mi veniva chiesto di disegnare i primer per amplificare una sequenza di partenza che però era in mRNA; dalla sequenza data di mRNA io scrivo il cDNA e su quella poi disegno primer forward (complementare alla sequenza senso) e reverse (complementare alla sequenza antisenso revertito per averlo in direzione 5'-3') ma su una sequenza da amplificare da dove parto con esattezza con il disegno del primer? dal primo codone di inizio che trovo sulla sequenza che mi viene data per il forward e dal primo codone di stop per il reverse? o parto in modo "casuale"?
E nel caso mi venga chiesto di inserire siti di restrizione (ad esempio ecoRI e bamH1) semplicemente li affianco all'estremità 5' del primer o devo aggiungere anche qualche nucleotide prima del sito di restrizione in modo da far accomodare sulla sequenza il sito di restrizione?
Ringrazio tutti voi in anticipo 
Matilde G.
ps.: dato che in passato è stato chiesto sono al 3 anno di biotecnologie 
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 27 agosto 2014 : 15:45:03
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Citazione:
ma su una sequenza da amplificare da dove parto con esattezza con il disegno del primer?
Dipende da cosa devi fare. Se devi amplificare esattamente dal nucleotide x al nucleotide y allora dovrai avere un primer che inizia su x e uno che finisce su y. Se invece stai generando dei primers per una PCR qualitativa (es. per fare genotyping, in cui ti serve solo determinare se un allele è presente o meno) sceglierai tu il punto da cui partire.
Citazione:
E nel caso mi venga chiesto di inserire siti di restrizione (ad esempio ecoRI e bamH1) semplicemente li affianco all'estremità 5' del primer o devo aggiungere anche qualche nucleotide prima del sito di restrizione in modo da far accomodare sulla sequenza il sito di restrizione?
Non ho capito esattamente la domanda. Nel contesto dell'esame puoi affiancarli al primer, nella pratica ci possono essere situazioni diverse ovviamente. |
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Matilde G
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 27 agosto 2014 : 16:25:56
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Citazione:
Dipende da cosa devi fare. Se devi amplificare esattamente dal nucleotide x al nucleotide y allora dovrai avere un primer che inizia su x e uno che finisce su y. Se invece stai generando dei primers per una PCR qualitativa (es. per fare genotyping, in cui ti serve solo determinare se un allele è presente o meno) sceglierai tu il punto da cui partire.
In tutti gli esercizi che mi sono capitati non specificava il fine della pcr da allestire ma veniva solo chiesto di disegnare i primer di una sequenza data da amplificare.. quindi mi sembra di capire che la scelta del punto di partenza è arbitrario o comunque dipendente "solo" dal fatto che partendo da un punto della sequenza piuttosto di un altro ottengo un primer migliore. correggimi se ho frainteso..
Citazione:
E nel caso mi venga chiesto di inserire siti di restrizione (ad esempio ecoRI e bamH1) semplicemente li affianco all'estremità 5' del primer o devo aggiungere anche qualche nucleotide prima del sito di restrizione in modo da far accomodare sulla sequenza il sito di restrizione?
Non ho capito esattamente la domanda. Nel contesto dell'esame puoi affiancarli al primer, nella pratica ci possono essere situazioni diverse ovviamente.
mi riferisco al solo contesto dell'esame consapevole che nella pratica è tutto notevolmente piu complesso!
Affianco il sito di restrizione al primer, ma è comunque opportuno che io inserisca qualche base prima del sito di restrizione per assicurarmi che il sito di restrizione si "sieda" dove voglio? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 02 settembre 2014 : 10:05:00
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Citazione:
In tutti gli esercizi che mi sono capitati non specificava il fine della pcr da allestire ma veniva solo chiesto di disegnare i primer di una sequenza data da amplificare.. quindi mi sembra di capire che la scelta del punto di partenza è arbitrario o comunque dipendente "solo" dal fatto che partendo da un punto della sequenza piuttosto di un altro ottengo un primer migliore. correggimi se ho frainteso..
Se ti dice che la sequenza è:
ATCTATCTAATGTTTTGACATCCTACG[....]TCGCCCTATCCCCTAACTG
e che devi amplificare dalla terza T all'ultima A, farai partire il primer dalla terza T e lo farai finire all'ultima A.
Se invece ci sono altre indicazioni beh... segui le altre indicazioni!
Se non ci sono indicazioni scegli il primer "migliore", sapendo che nella pratica il primer migliore è quello che amplifica quello che ti serve!
Citazione:
Affianco il sito di restrizione al primer, ma è comunque opportuno che io inserisca qualche base prima del sito di restrizione per assicurarmi che il sito di restrizione si "sieda" dove voglio?
Sì aggiungi qualche base per assicurarti che l'enzima di restrizione (non il sito) possa tagliare. |
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