Forum

Utilità
Cerca nel sito:
Scrivimi Contattaci
Glossario Dizionario
Strumenti per interagire con il sito Tools
Mappa del sito Mappa del sito
I libri
consigliati:

Virologia
Virologia
Renato Dulbecco, Harold S. Ginsberg

Il gene VI
Il gene VI
Benjamin Lewin

Cantico di una vita
Cantico di una vita
Rita Levi Montalcini

Altri Libri
Nome Utente:
 Password:
Riconoscimi automaticamente
 Tutti i Forum
 MolecularLab
 Biologia Molecolare
 Touchdown PCR		  Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
I seguenti utenti stanno leggendo questo Forum Qui c'è:
Risorse di Biologia Molecolare: Didattica Blog Inside the Cell Protocolli Siti di Biologia Molecolare e Tecniche Quiz Ultime notizie

Aggiungi Tag Aggiungi i tag

Quanto è utile/interessante questa discussione:

Autore Discussione  

Biochica
Utente Junior




285 Messaggi
Inserito il - 06 marzo 2007 : 15:08:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Biochica Invia a Biochica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti!
Da qualche tempo sto litigando con la PCR per l'amplificazione di un segmento GC rich (non è una mia scelta e non ho alternative)
Dopo una serie di tentativi sono riuscita ad ottimizzare una PCR con risultati quasi accettabili...aggiunta di DMSO in concentrazione finale 5% e a mettere un eccesso di un primer rispetto all'altro 1:6...non contenta il ciclo della PCR è un touchdown...il problema è che continuo ad avere un aspecifico a circa 1000bp oltre alla mia banda assolutamente splendida a 400bp...qualcuno sa come giocare col ciclo della touchdown?il ciclo non è qllo tradizionale (ve l'avevo detto che sto facendo una cosa impossibile, no?)ma all'inverso...cioè:
95°C 1'
95°C 30''
63°C 30'' 15 cicli
72°C 1'10''
95°C 30''
63°C-53°C 30'' 20 cicli
72°C 1'10''
Grazie mille a chi ha qualche idea...Chiara
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit-

valia
Moderatore


Prov.: UK


1001 Messaggi
Inserito il - 06 marzo 2007 : 16:08:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valia  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di valia Invia a valia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma hai provato con il touchdown classico?

Messo cosi secondo me quel programma non ha tanto senso, perche dopo i primi 15 cicli a 63 C secondo me nella tua reazione hai gia' l'aspecifico.. E nei cicli successivi non fai altro che aumentarne la quantita', visto che la temperatura diminuisce.


La teoria dietro al touchdown e' che i primi (pochi!!) cicli ad alta temperatura permettono l'amplificazione di (poco) prodotto specifico.. I cicli successivi (ad una temeratura minore) ne aumentano la quantita'.

Per ottenere alta specificita' nella reazione e' necessario che i primi cicli abbiano condizioni molto stringenti (quindi alte temperature). E'un passaggio critico perche qualsiasi prodotto dei primi cicli verra' amplificato enormemente successivamente.

Perche non fai un touchdown classico, con i primi 5 cicli con temperatura di annealling da 69 a 64 C, poi fai 30 cicli a 63 C.
Torna all'inizio della Pagina

Biochica
Utente Junior




285 Messaggi
Inserito il - 06 marzo 2007 : 16:27:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Biochica Invia a Biochica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho già preso in considerazione la touchdown tradizionale...una vera tragedia...il nulla di nulla...ma proprio nulla...
Con questo ciclo sono riuscita ad eliminare altri 3 aspecifici...sfortunatamente continuo a trascinarmi questo...
Ti dirò...la prima volta che ho ottenuto questo risultato il mio capo e la mia collega hanno deciso di sequenziare il frammento...incredibilmente la sequnza è venuta benissimo oltre che inaspettatamente pulita...loro si sarebbero pure accontentati (la mia collega tentava di far venire la PCR da un paio di mesi e noi dovevamo refertare il paziente...) io sono una rompi scatole e prima di ufficializzare il protocollo vorrei togliere ogni tipo di problema...
Cmq tenterò con il tuo suggerimento...il paziente non ha mutazioni e l'allarme è rientrato...ma qdo mi fisso su una cosa...
Grazie ancora!Chiara
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit-
Torna all'inizio della Pagina

valia
Moderatore


Prov.: UK


1001 Messaggi
Inserito il - 06 marzo 2007 : 16:38:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valia  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di valia Invia a valia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ah ah, allora ormai e' una sfida personale

In bocca al lupo e tienici informati!

Ciao ciao
Torna all'inizio della Pagina

Biochica
Utente Junior




285 Messaggi
Inserito il - 06 marzo 2007 : 16:46:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Biochica Invia a Biochica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Più che una sfida una guerra
ora ho trovato in rete anche articoli in cui citano la combinazione micidiale DMSO 10% (già provato con tutto quel DMSO non viene manco l'aspecifico..) e betaina...tra un po' ci sputo dentro

Comunque grazie mille Valia
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit-
Torna all'inizio della Pagina

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi
Inserito il - 06 marzo 2007 : 19:02:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io non sono mai andata d'accordo con la Touch Down!

Comunque hai provato a variare anche i tempi di allungamento???
Se il tuo prodotto specifico è 400bp e l'aspecifico è maggiore (1000bp), puoi provare anche con un tempo di allungamento inferiore ad. es 30 sec. che sono sufficienti per ultimare l'allungamento della banda da 400bp!


In bocca al lupo!!!
Torna all'inizio della Pagina

Biochica
Utente Junior




285 Messaggi
Inserito il - 07 marzo 2007 : 12:27:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Biochica Invia a Biochica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie del suggerimento GFPina ma purtoppo ci avevo già provato...diminuento il tempo di elongation un'altra volta PCR bianca...
Cmq tra ieri e oggi ho giocato con la mia PCR ancora un po'...calando i cicli durante il decremento di temperatura la PCR viene da benissimo e...NESSUN ASPECIFICO!
Ora siamo pronte a rifare la PCR sul nostro paziente (ovviamente fino ad ora ho usato un DNA di controllo...il mio...)e a sequenziarlo nuovamente! EVVIVA!
E ora pronta nuove avventure...dovrei riprendere il mio lavoro con le proteine...
Baci e grazie! Chiara
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit-
Torna all'inizio della Pagina
  Discussione  

Quanto è utile/interessante questa discussione:

 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
Vai a:
MolecularLab.it © 2003-18 MolecularLab.it Torna all'inizio della Pagina