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Western blot proteine fosforilazione bande aspecifiche

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5ringsman
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11 Messaggi

Inserito il - 17 ottobre 2014 : 03:54:15

Ecco il mio problema:
Evo identificare su western blot la presenza di alcune proteine fosforilate.
Ho bloccato la mia membrana con TBST 0.1%, BSA 5% per 1 ora e ho usato lo Stefano buffer per diluire gli anticorpi.
Il problema � che ottengo solo una striscia pressoch� continua di bande aspecifiche.
Altri anticorpi contro proteine non fosforilate funzionano bene sulla stessa membrana.
Che devo fare? Cosa sto sbagliando!

Vi ringrazio tantissimo, ne va del mio PhD!!

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 17 ottobre 2014 : 10:32:06

Domanda stupida: hai usato inibitori delle fosfatasi nella tua estrazione?
Di solito si usano il fluoruro di sodio, NaF, ed il sodio ortovanadato, Na3VO4.

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5ringsman
Nuovo Arrivato

11 Messaggi

Inserito il - 17 ottobre 2014 : 17:39:33

Citazione:
Messaggio inserito da chick80

Domanda stupida: hai usato inibitori delle fosfatasi nella tua estrazione?
Di solito si usano il fluoruro di sodio, NaF, ed il sodio ortovanadato, Na3VO4.

Si, ho usato il cocktail proto PhosphoSTOP. Ma anche fosse quello il problema, dovrei non aver nessuna banda, invece io ne ho fin troppe!

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 17 ottobre 2014 : 19:19:28

Citazione:
dovrei non aver nessuna banda, invece io ne ho fin troppe

Beh, sai, � sempre una questione di rapporto segnale/rumore. Le bande aspecifiche ci sono sempre, ma se il segnale � forte non le vedi :)

L'altra cosa ovviamente � cambiare l'anticorpo...

In ogni caso, che cosa sarebbe lo Stefano buffer????

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5ringsman
Nuovo Arrivato

11 Messaggi

Inserito il - 17 ottobre 2014 : 20:13:40

Scritto da MolecularLab Mobile

� "lo stesso buffer" col correttore automatico! ;)

eletav
Nuovo Arrivato

2 Messaggi

Inserito il - 06 novembre 2014 : 11:24:38

Prova a strippare il filtro e risaturarlo con BSA(2%)-OVA(3%)..

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