| Autore |
Discussione |
|
|
mari82
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
 Inserito il - 14 marzo 2007 : 23:04:34
|
Ciao ragazzi,
nel laboratorio nel quale lavoro è necessario comprare tutti i reagenti x poter fare una PCR, una RT-PCR ed estrarre RNA e DNA da cellule e tessuti.
Fino a poco tempo fa ero una semplice studentessa e non mi ero mai occupata degli ordini... ora invece la situazione è cambiata e mi ritrovo a dover scegliere cosa comprare. Non vorrei fare danni (nel senso di comprare prodotti sbagliati), quindi vorrei sapere cosa pensate dei prodotti che sto ordinando.
X la PCR sto ordinando dalla Fermentas:
TRUE START Taq DNA POLYMERASE 100U
dNTP set
MASS RULER DNA LADDER LOW RANGE (x poter fare una sorta di quantizzazione del prodotto di PCR)
X la RT-PCR:
AFFINITY SCRIPT MULTIPLE TEMPERATURE REVERSE TRANSCRIPTASE (della STRATAGENE)
RIBO RULER RNA LADDER LOW RANGE 1000-100
X l'elettroforesi dell'RNA (ho già i reagenti x un gel di agarosio x DNA,quindi non devo ordinarli, credo che sia questo quello che mi serva x l'RNA):
tampone MOPS 10x
Formaldeide
DEPC 25 GR (a proposito, qualcuno sa dirmi come si prepara l'H2O-DEPC?)
X estrarre l'RNA da tessuti (parto da quantità molto piccole di tessuto, pochi mg):
TRIZOL (TRI-REAGENT)25ML
alcole iso-propilico Baker 1l HDPE
PHENOL:CHLOROFORM 5:1 100ML
mussel glycogen
Sapete consigliarmi qualche kit x estrarre DNA da tessuti e cellule (la quantità di campione iniziale è bassa e vorrei avere delle rese accetabili)?
Dalla lista che ho fatto, manca qualcosa x poter allestire queste metodiche? Cosa pensate dei prodotti che ho scelto?
Grazie mille
Marianna
|
|
|
|
|
Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2007 : 09:23:41
|
Ciao Marianna...
Dunque...
Per la Taq noi usiamo la platinum e il dNTPs kit della invitrogen, per il ladder sono daccordo anche se in realtà secondo me il mass ruler ha talmente un casino di bande che normalmente mi incasino a guardarlo, se sai il size della banda io preferirei un 100bp o un 50 bp per bande fino a 1000bp, o l'1kbp per size maggiori.
Per l'estrazione dell'rna ok per il trizol dell'invitrogen, se guardi sul sito dell'invitrogen c'è anche la sezione protocolli dove c'è il protocollo per l'estrazione con tutti i reagenti (ma mi sembra siano isopropanolo, cloroformio e acqua depc)
Per l'acqua depc abbiamo la soluzione della sigma...devi diluirla allo 0.1% (dovrei verificare in lab la diluizione pero) con acqua buona e lasciare la bottiglia overnight in agitazione a 37°C e poi autoclavarla il giorno dopo...qdo la usi fatti delle aliquote!
Poi...kit per la retro usiamo l'MuMLV della fermentas, i random esameri dell'invitrogen e l'RNasin della Eppendorf, per i dNTPs puoi usare anche uno stock nuovo di quelli che usi per la PCR ma magari puoi farti delle aliquote in acqua depc
Resta l'elettroforesi...noi facciamo tutto come per quella di DNA sia l'agarosio che il TBE, l'uinca accortezza è di lavare la vasca subito prima e di metterci il tampone pulito per la corsa...per la verità noi quantifichiamo allo spettrofotometro prima e poi carichiamo da 0.5 a 1 ug di RNA in modo da vedere la pulizia dell'RNA e l'eventuale degradazione...
Per i kit so dirti poco...noi lavoriamo con sangue e facciamo il salting out senza fenolo, in casi particolari usiamo un kit per sangue della roche, ma per il lavoro che faccio io uso anche un kit della invitrogen abbastanza generico (va bene per cellule di mammifero,tessuti,lieviti,batteri...)si chiama purelink...
In bocca al lupo per l'allestimento,fammi sapere se ti serve qualcosa Chiara |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
 |
|
|
mari82
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2007 : 15:00:54
|
Ciao Chiara,
grazie mille x avermi risposto.
Volevo chiederti una cosa: ho già i primers x la RT, quindi posso comprare solo l'enzima e il relativo buffer???
Ho deciso di prendere l'acqua già trattata con DEPC dalla Fermentas, è meno costosa di quella della Sigma... devo far quadrare il bilancio e non allargarmi troppo con i costi.
Cosa pensi della Taq della fermentas?
http://www.fermentas.com/catalog/modifyingenzymes/truestartpol.htm
Mi pare sia buona sia x amplificare DNA genomico che cDNA. Puoi darmi un tuo parere?
Ancora grazie x il tuo prezioso aiuto!
|
|
|
|
Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2007 : 15:36:34
|
Hey...spero di riuscire a finire di risponderti perchè è la terza volta che ci provo e qualcuno mi interrompe...così perdo tutto qllo che ho scritto...
Dunque...se i primer ce li hai già vai serena e prenditi pure enzima+buffer (quello della fermentas è pure economico), a costare è l'RNasein ma ti dura un sacco di tempo!
Non conosco la taq della fermentas ma di solito ha buoni enzimi (ho avuto problemi solo con la T4 ligasi...), cmq se ti serve una taq economica, qllo che lo è di più in assoluto è la biotools
http://www.biotools.net/eng/frameset_productos.htm
il rivenditore italiano dovrebbe essere ancora la biospa...io non mi ci trovo male...è un po' delicata però...di solito la uso per lo screening di colonia batteriche visto il vantaggio del costo rispetto al grande numero di campioni da analizzare o per ottimizzare pcr qdo i ragazzi della diagnostica del lab dove lavoro vanno fuori di testa e non sanno più che inventarsi...
Per l'acqua cerca di stimare il consumo e il package...noi preferiamo la soluzione da diluire della sigma perchè molte patologie che seguiamo vanno su rna e di conseguenza serve un botto d'acqua...tra le atre cose...
Dimmi se ti serve altro...Chiara |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
|
|
|
mari82
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2007 : 16:31:32
|
sapresti consigliarmi su quale RNAsi comprare?
Thanks
Marianna |
|
|
|
Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2007 : 16:35:11
|
Noi usiamo la eppendorf...mi pare quella da 1000 reazioni e ci dura circa un anno...
Mi sono appena ricordata di dirti che prima della retro faccio anche il trattamento con la DNase I...fidarsi è bene...anche se non tutti in lab lo fanno...cmq uso l'invitrogen anche in qsto caso...cmq se dovessi usare il kit molti hanno anche le colonnine per il trattamento DNase direttamente in colonna |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
|
|
|
mari82
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2007 : 16:50:52
|
| Ops, solo adesso mi sono accorto che nel messaggio di prima mi sono mangiata la parola inibitore... cmq hai capito quello che ti ho chiesto. Grazie mille... |
|
|
|
Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2007 : 16:54:04
|
Tranquilla...
|
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
|
|
|
mari82
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 15 marzo 2007 : 21:38:38
|
Per l'acqua DEPC puoi anche comprarti un boccettino di DEPC (che ti durerà per un bel po') e trattare tu l'acqua. Non ho sottomano il protocollo, ma se non ricordo male mettevo 1:1000 DEPC nell'acqua SOTTO CAPPA e lasciavo sullo stirrer o/n. Il mattino dopo il DEPC è sciolto e puoi autoclavare il tutto.
Comunque puoi anche usare MilliQ autoclavata, io non ho mai avuto contaminazioni e ci facevo RT-realtime senza problema alcuno. |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 16 marzo 2007 : 10:03:28
|
Mi sono data una letta al datasheet. Non mi sembra male! Mi raccomando segui quello che ti indicano perchè qui in lab tempo fa è successo un casino con la DNaseI.
Non ti preoccupare non mi stai assillando affatto!
Chica |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
|
|
|
mari82
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 17 marzo 2007 : 12:36:39
|
Ciao ragazzi,
ordini completati... ho deciso di testare i kit di estrazione della Qiagen, mi sembrano molto buoni, con rese alte!
Ho comprato anche la DNase I... nel lab dove lavoro il prof ha dato carta bianca a me e all'altra ragazza che lavora con me x comprare tutto quello che ci serve, senza però esagerare con i costi! E noi abbiamo ritenuto opportuno comprare la DNase I...
Grazie mille x il vostro aiuto!
Buon fine settimana
Marianna
|
|
|
| |
Discussione |
|
Allestimento PCR, RT-PCR ed estrazione DNA/ RNA
Didattica
