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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
 Inserito il - 21 marzo 2007 : 10:44:04
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Mi è venuto un dubbio, per correre con una SDS-PAGE dei campioni denaturati, l'SDS dove deve essere presente?
1) nel loading buffer che aggiungo ai campioni prima di caricarli e nel gel in cui carico i campioni, ma non nel tampone che utilizzo per la corsa contenente TRIS e Glicina.
2) Nel loading buffer, nel gel ed anche nel tampone di corsa.
Quale delle due secondo voi è la cosa giusta?
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2007 : 11:24:00
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Dunque...mi hai fatto venire un superdubbio e sono andata e riverificare i miei protocolli...l'SDS va sia nel loading buffer, nel gel e anche nel tampone di corsa!
Buon lavoro!
Chica |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2007 : 11:31:10
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Scusa se mi vengono questi dubbi, dopo aver preparato il tampone di corsa lo portate a pH 8.3
Infatti un protocollo mi dice che il tampone di corsa a pH 8.3, però una dottoranda mi dice che bisogna solo verificare il pH e non aggiungere l'HCl per ottenere il pH desiderato.
Io comunque notando che il pH era 8.75, l'ho portato a pH 8.3 con HCl, infatti non credo che l'HCl possa in qualche modo influenzare la corsa dei campioni.
Voi portate il pH della soluzione 10x del tampone di corsa ad 8.3?
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2007 : 11:37:44
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Verifica effettuata...in effetti non pHiamo nemmeno noi...
L'unica cosa che porto a pH sono i TRIS-HCl per il gel |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2007 : 11:40:06
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| Quindi secondo te dovrei buttare quella soluzione? Datemi altri pareri più confortanti please!! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2007 : 13:57:12
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Se hai preparato tutto correttamente non devi buttare niente:
un tampone Tris-HCl (come il running buffer dovrebbe essere) pHato
con HCl va benissimo. Si può anche fare a meno di pHare, ma è sempre un rischio.
L'SDS va aggiunto anche al running buffer, ed alla concentrazione 'giusta'
(dipende dal tuo protocollo) altrimenti rischi che l'SDS sciolto nel campione
si disperda nella camera, dopo il caricamento. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2007 : 14:50:21
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Io faccio i gel senza SDS, lo metto solo nel loading e nel buffer di corsa.
Se i quantitativi di tris e glicina sono giusti non è necessario portare a pH.
Se poi vogliamo togliere le pulci ai pidocchi il Cl influisce nella corsa elettroforetica, è il responsabile dell'"appiattimento" del fronte di corsa nello stacking. |
Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2007 : 15:12:56
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l'SDS lo metto nel tampone di corsa (5 g/L), nel loading buffer (anche se io il loading non lo preparo, ma lo compro pronto per l'uso), e anche nel gel (l'1% di una soluzione di SDS al 10%).
Il tampone di corsa non lo porto a pH, ma faccio sempre almeno un controllo, soprattutto quando è un tampone un po' vecchio. e uniche soluzioni che ho sempre pHato sono quelle che servono per fare i gel:TrisHCL 6,8 e TrisHCL 8.8
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2007 : 16:06:57
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Oggi ho anche blottato con SDS 
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2007 : 19:02:57
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Beh.. solo per completare quanto detto e spiegare cosa realmente succede nel gel durante l'SDS-PAGE e a cosa servono i tamponi a differenti pH leggete:
HOW DOES AN SDS PAGE GEL REALLY WORK?
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2007 : 19:05:10
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Citazione:
Messaggio inserito da valia
Oggi ho anche blottato con SDS
A proposito, io blotto con SDS, non serve ma uso lo stesso buffer che uso per l'elettroforesi con aggiunta di metanolo... tanto perchè ho il buffer già pronto e non sto a comprarne o a farne un'altro!  |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2007 : 19:30:55
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GRAZIE!!!!!!!!
Tutti ad insultarmi qui in lab, ma caspita, running e transfer buffer son praticamente la stessa cosa, un po' di elasticita'! Cosa puo' fare quel 1% di SDS in piu'?
Io ho preso una bottiglia per un'altra per sbaglio, ma gia' meditavo di provare e di risparmiarmi di fare 2 buffer diversi!
Grazie grazie, non sai quanto mi senta meno scema ora
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2007 : 19:54:36
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| anche io faccio, o meglio facevo, come GFPina! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2007 : 00:59:02
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Sul serio? Se solo provassi a fare sta cosa nel mio lab,
(tipo magari versare il running nella bottiglia del transfer....)
dicendo 'tanto sono uguali, basta aggiungere il metanolo'
credo che finirei barbaramente martoriato.
A ognuno le sue "fisse". . . |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Tampone di corsa
Didattica
