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mika
Nuovo Arrivato
Prov.: Como
Città: como
2 Messaggi |
 Inserito il - 24 marzo 2007 : 09:36:18
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Ciao a tutti,
ho un problema con un western blot: usando un certo Ab vedo solo bande aspecifiche, ma dopo 2stripping e 2 incubazioni con 2diversi Ab (proteine ad altezze diverse), sembra che le bande della proteina iniziale siano comparse (l'altezza è proprio quella e quasi sicuramente non sono aspecifici degli altri 2 anticorpi). Può essere?! Il laboratorio che ci ha fornito il primo Ab dice che anche loro hanno problemi: infatti perchè si vedano le bande, prima guardano la proteina housekeeping, poi fanno lo stripping e quindi incubano con l'Ab di interesse, mentre se usano direttamente il primo Ab sulla membrana "nuova", le bande non si vedono. A qualcuno è mai successo niente di simile e ha una spiegazione/un consiglio?
Grazie!
Mika[
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 24 marzo 2007 : 15:37:00
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| Cambia anticorpo! |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 24 marzo 2007 : 21:05:21
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Anch'io opterei per il cambio di anticorpo... |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 24 marzo 2007 : 21:18:22
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ma avete provato a contattare il referente per la ditta che produce questi anticorpi? è molto strano...
in ogni caso ti consiglio di leggere bene il datasheet e concordo sul cambio di anticorpo  |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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mika
Nuovo Arrivato
Prov.: Como
Città: como
2 Messaggi |
Inserito il - 25 marzo 2007 : 13:54:43
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In realtà l'anticorpo è stato fatto da un altro laboratorio del nostro istituto.loro lo usano su linee celulari umane (funziona se usato dopo uno stripping), noi su colture primarie di ratto, ma la proteina è quasi uguale. Abbiamo provato due anticorpi commerciali (e non ce ne sono molti altri contro la fratassina), ma non si vede nulla, seguendo i datasheets pari pari!! sarà un problema di lisi? boh!
mika |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 25 marzo 2007 : 17:41:11
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un problema di lisi dici? non credo, almeno da quel che mi ricordo io la fratassina dovrebbe avere localizzazione citosolica, quindi è una proteina abbastanza facile da estrarre. ma lavorate su lisati semplici o su immunoprecipitati?
comunque, ho provato a dare uno sguardo sul pubmed e mi sono usciti parecchi lavori sulla fratassina, magari potresti provare a vedere che tipo di buffer di lisi hanno usato. |
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