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ChEyEnNe
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
 Inserito il - 27 marzo 2007 : 13:06:48
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proprio oggi un rappresentante mi ha parlato di anticorpi secondari coniugati che permettono di vedere la proteina direttamente sulla membrana (al transilluminatore), senza fare lo sviluppo della lastra!
Per "soluzioni che funzionino" cosa intendi? Tipo buffer di corsa, di trasferimento etc? In quel caso li puoi preparare anche tu.
Poi devi sapere che tipo di membrana usare, se PVDF, nitrocellulosa ecc. Devi avere un anticorpo specifico per la tua prt e un relativo secondario. Per la rivelazione sulla lastra della tua banda di interesse si usano delle soluzioni che reagiscono con l'Ab secondario per reazione di chemiluminescenza.
Per quanto riguarda direttamente la lettura sul gel...io non ne so niente, ma se non fai il trasferimento che sfizio c'è ?
se hai bisogno fammi sapere, anche se vuoi i protocolli delle soluzioni.
Ciao |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2007 : 14:40:49
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I kit che dici non li conosco io ne uso uno della Roche (BM Chemiluminescence Western Blot Kit), a suo tempo ne ho provati molti!
Il più usato nei vari laboratori e l'ECL (Amersham)!
Io come già detto in un altro post ho avuto brutte esperienze con la visualizzazione direttamente su gel, la sensibilità è inferiore rispetto alla membrana, anche se adesso penso che i kit siano migliorati!
Citazione:
Messaggio inserito da ChEyEnNe
... o se invece bisogna comunque fare gli step con gli anticorpi.
P.S. anche se non usi la membrana gli anticorpi li devi usare lo stesso!!!
Se hai bisogno altre info facci sapere! |
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Black Mamba
Nuovo Arrivato
Città: Roma
24 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2007 : 18:21:14
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ciao, io in laboratorio uso sempre l ' ECL dell amersham... è un kit ke fornisce 2 boccette di cui una scura , l altra chiara.si mettono in un eppendorf in un rapporto 1:1 .di solito per coprire un filtro ne sono sufficienti 600 microlitrii totali.Gli anticirpi primari e secondari li devi cmq usare ...dopo aver usato l ecl se vuoi strippare il filtro fai attenzione a lavarlo x 2 volte x 10 minuti in pbs... per togliere via il reagente!!!!spero di esserti stata utile!!! |
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ChEyEnNe
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 28 marzo 2007 : 18:35:00
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Grazie a tutti per avermi risposto. 
Ora spiego meglio il tutto:
In laboratorio abbiamo uno strumento che pensavo potesse leggere direttamente il gel ma mi è stato detto che ciò non è possibile vista la mia proteina (8KDa) 
Dunque il percorso che dovrò fare è questo:
1)separazione delle proteine su gel acrylamide
per questo passaggio io possiedo cell gs4.1 con la mia proteina nel citoplasma. qui nel forum ho visto che posso procedere con: lavaggio delle piastre 2 volte con pbs + 500 µl di cocktail di inibitori delle proteasi e poi scraper; risospensione in 40 µl di inibitori di proteasi + 1% di Igepal; lasciare in ghiaccio 15'; centrifugare 15' a 12000 rpm a 4°C; trasferimento in provetta.
Ho letto su alcune pubblicazioni che potrei lisare anche con sonicatore ma penso che così facendo potrei essere troppo invasivo e distruggere tutta la cellula. Ditemi un pò voi.......
2)determinare la concentrazione delle proteine
uso gel di poliacrilammide (SDS-PAGE); penso di aver capito che dovrei usare quello ad 1,5 mm con un range tra 15 e 20 % bis-tris gel, per proteine della mia grandezza. A che lunghezza d'onda dovrei leggere poi? 280nm ?
3) trasferimento in membrana(uso nitrocellulosa).
soluzione tampone a pH basico + SDS + NP40. Il gel viene sistemato sulla mambrana con la stessa soluzione basica. A questo punto che faccio? mi servono delucidazioni circa il proseguire 
4)blocco della membrana.
uso un tampone che contiene proteine come BSA, milk per bloccare i siti non specifici
5) incubazione I Ab
IGg mouse (236-A dell'invitrogen); mi dareste i tempi?
6)lavaggio
qui?
7) II Ab
goat antimouse HRP coniugato
8)lavaggio
e qui invece?
per qualunque altra informazione che potrebbe servire, chiedete pure
io vi ringrazio già per questo  |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 28 marzo 2007 : 19:12:29
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allora, rivediamo un attimo il percorso che hai scritto tu:
1)per lisare le cellule e prendere le proteine ci sono vari tipi di buffer di lisi. va bene il lavaggio delle cellule 2 volte in pbs (usalo freddo e dal momento in cui cominci con i lavaggi tieni le piastre in ghiaccio) e poi raccogli le cell (sempre in pbs). Centrifughi e fai pellettare le cell. A questo punto puoi ripetere i lavaggi in pbs e le centrifugazioni. ottenuto il pellet finale, aggiungi il tuo specifico buffer di lisi (nel quale aggiungi il cocktail di inibitori) e screpi. Io lascio agire il buffer per 30 minuti in agitazione in camera fredda. Poi centrifugo ancora per 30 minuti e ottengo il pellet (fatto da schifezze, membrane etc) e il surnatante che sono le proteine.
Puoi usare il sonicatore, ma io non ti posso dire molto perchè non l'ho mai usato. Forse qcn + esperto può aiutarti. ricorda di lavorare in ghiaccio per questi passaggi
2)A questo punto fai il dosaggio. le proteine leggono a 595!!!
3) fatto il dosaggio, sospendi le proteine in laemli sample buffer e corri
i campioni su gel. Vedi bene a che % preparare il tuo gel perchè 8 Kda sono veramente pochini e la tua proteina è molto piccola.
4) finita la corsa, ti prepari per il trasferimento. Tieni almeno per 10 minuti gel, carta wathman e spugne in transfer buffer, prima di trasferire. ti servono tutti i passaggi del trasferimento? fammi sapere.
5)Blocca al membrana con milk 5% o bsa 5% preparati in TBST 1X per 1 ora (in genere io uso bsa quando cerco una forma fosforilata). al termine del blocco lava con TBST, in genere 1 lavaggio da 10 minuti e 2 da 5
6) incubazione con abI (diluito quanto? cosa dice il data sheet?), in genere per essere sicura tienilo over night a 4 °C possibilmente in agitazione. l'Ab I lo puoi diluire in milk o bsa 3%. finita l'incubazione lava la membrana, come sopra
7)incuba la membrana con abII (in genere il II si usa 1:5000 con alcune eccezioni) diluito in milk o bsa 3% preparati sempre con TBST 1X per 45 minuti. alla fine ricorda sempre i lavaggi.
8)prepara l'ecl e vai a sviluppare!
in bocca al lupo e se hai bisogno di altro chiedi pure.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 28 marzo 2007 : 19:19:42
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Citazione:
Messaggio inserito da ChEyEnNe
uso gel di poliacrilammide (SDS-PAGE); penso di aver capito che dovrei usare quello ad 1,5 mm con un range tra 15 e 20 % bis-tris gel, per proteine della mia grandezza. A che lunghezza d'onda dovrei leggere poi? 280nm ?
Il gel ti serve per separare le proteine, la lettura della concentrazione in genere si fa prima sul lisato totale! Nel tuo laboratorio non avete un kit per la lettura della concentrazione?
Citazione:
Messaggio inserito da ChEyEnNe
5) incubazione I Ab
IGg mouse (236-A dell'invitrogen); mi dareste i tempi?
non so che anticorpo sia, ma presumo che sia un anticorpo contro la tua proteina...
devi incubare 1h a Tamb oppure over night a 4°C
Citazione:
6)lavaggio
qui?
3 lavaggi da 10-15min in TBS/Tween
Citazione:
8)lavaggio
e qui invece?
2 lavaggi da 10-15min in TBS/Tween
1 lavaggi da 10-15min in TBS
e poi devi usare un kit per la rivelazione chemiluminescente ad es. ECL
poi dipende se il tuo strumento legge direttamente la chemiluminescenza oppure se devi sviluppare una lastra!!! |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2007 : 00:04:55
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| Iside, perche usi BSA invece del latte qundo cerchi una forma forsforilata? Qual'è la differenza? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2007 : 03:28:56
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| Solitamente si usa il latte per gli anticorpi monoclonali e la BSA per i policlonali, ma per esperienza personale ti posso dire che conviene provare e vedere quale viene meglio, perchè la storia di mono o policlonale non funziona sempre. |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2007 : 12:32:10
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tra l'altro a me hanno sempre detto che la bsa può interferire con le proteine fosforilate, per questo dicono di usare in questo caso il latte. Anche se ultimamente sto usando solo il latte e mi trovo benissimo comunque, anzi, la lastra viene fuori molto pulita.
ps: scusa valia, ma ho scritto una cosa non vera nel post precedente, quindi, milk per le forme fosforilate e bsa per tutto il resto...in linea di massima. |
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ChEyEnNe
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2007 : 13:44:58
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Grazie tante iside
Se mi posteresti anche i passaggi per il trasferimento ?
Bene o male sono riuscito a creare il mio protocollo per il western blot......
Una volta completato lo posterò qui ed eventualmente potreste dirmi se sbaglio e dove....
Poi inizierò a fare qualche prova e dirò se andrà bene. Se andrà tutto bene lo inserirò nella sezione dei protocolli e sarà merito vostro  |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2007 : 19:34:52
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ciao.
allora, per il trasferimento io faccio in questo modo:
1)al termine della corsa tieni gel, membrana e spugna in transfer buffer. Questo vale per membrane in nitrocellulosa, mentre per quelle in PVDF la procedura è un po' diversa, nel senso che vanno idratate. Prova a cercare, in qualche vecchio topic se ne parla.
2)Monta il sandwich: spugna, carta (2 fogli), gel, membrana, carta (2 fogli), spugna. Ricorda che se fai un'SDS-PAGE le proteine corrono e vengono trasferite verso il polo positivo, quindi devi fare attenzione a come monti il sandwich nella cameretta di corsa, perchè se lo monti "al contrario" perdereai tutto. ricorda anche che il trasferimento va fatto a freddo, cioè cerca di mettere la cameretta in un vassoio con del ghiaccio. I tempi variano da proteina a proteina, ma anche dall'amperaggio che applichi. Maggiore sarà l'amperaggio e meno tempo ci vorrà; per esempio io in genere trasferisco l'EGFR che pesa 170 kDa a 250 mA (costanti) e 150 V (massimo)per 1 he 30' Per proteine così piccole in linea di massima ti ci vorrebbe poco tempo. Un altro accorgimento:per evitare che tra gel e membrana si formino bolle (e quindi in quel punto le protiene non si trasferiscono)usa una pipetta sierologica e schiaccia bene, ma con delicatezza, la membrana sul gel, in modo da eliminare l'aria.
3)Terminato il trasferimento, c'è chi per sicurezza colora la membrana con rosso ponceau. Io non lo faccio perchè l'acido acetico contenuto nel ponceau può degradare le proteine, anche se in minima parte. Quindi salto questo step e metto la membrana con le proteine per 10' in TBST 1X e poi procedo con incubazioni, lavaggi, etc. Se però per te è il primo western blot, allora ti conviene colorare con il ponceau, per avere la certezza che sia andato tutto bene. Il ponceau va fatto agire il tempo sufficiente per visualizzare le proteine, poi sciacqua la membrana con acqua distillata e tante volte in TBST 1X per eliminare TUTTO il colore.
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ChEyEnNe
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2007 : 19:43:31
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ok grazie
ora metto tutto insieme e vedo un pò.
Propio poco fa il mio capo mi ha detto che su internet, nei siti delle case produttrici, ci sono i protocolli già pronti, come quelli dell'invitrogen.....Mi ha detto, di usare quello o qualcosa di simile, visto che per me è la prima volta
Per una volta che non faccio il fubo  |
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Discussione |
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Kit per western blot
Didattica e Relazioni
