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massimo_santoro
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
19 Messaggi |
 Inserito il - 29 marzo 2007 : 15:46:26
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Ciao a tutti gli utenti,
mi chiamo Massimo e sono un biologo molecolare. In questo periodo sono alle prese con dei western blot che mi danno un pò di problemi. Sto usando un'anticorpo che mi da molte bande aspecifiche, così ho deciso di bloccare la membrana con una soluzione al 10% di latte e 2% di BSA in TTBS. Dopo un paio di lavaggi ho aggiunto l'anticorpo primario in TTBS e 0,5% di latte;dopo 1 ora di incubazione e successi lavaggi ho messo il secondario sempre in TTBs e 0,5% di latte. Ho sviluppato con ECL e il segnale che ho ottenuto è molto specifico ma il fondo è scuro. Qualcuno ha qualche suggerimento da darmi per schiarire il fondo.grazie mille
Massimo
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massimo_santoro
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
19 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2007 : 16:43:47
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| yutre |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2007 : 21:02:30
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| Prova ad allungare il tempo di ciascun lavaggio e magari aumentarli di numero. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2007 : 09:43:47
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Non so a che diluizione utilizzi l'anticorpo secondario, io solitamente lo uso 1:5000 utilizzando poi l'ECL Amersham, quindi o provi ad usare il secondario più diluito o aumenti il numero di lavaggi dopo il secondario, o fai entrambe le cose, in questo modo vedrai che il fondo non sarà più scuro come prima.
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calcagnao
Nuovo Arrivato
Città: padova
25 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2007 : 10:31:30
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| ti consiglio di diminuire molto la concentrazione del secondario.Io ne ho usato un dil 1:20000 e tutto si era schiarito.Usavo poi BSA al 5%. auguri |
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massimo_santoro
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
19 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2007 : 10:43:24
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| le bande che ottengo non sono molto intense, ho paura che diluendo troppo il secondario anche il segnale diminuisce.cosa ne pensate?sia al primario che al secondario ho aggiunto 0,5% di latte. Voi che concentrazione usate?Come posso schiarire il fondo e mantenere un buon segnale? |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2007 : 13:54:44
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lava molto bene la membrana, allunga i tempi di lavaggio in TTBS e dopo aver messo l'ECL fai colare le goccine in eccesso. Tieni la lastra in sviluppo meno tempo, ma se usi l'ECL plus il fondo scuro è quasi la regola.
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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western blot
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