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bizio90
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 05 luglio 2017 : 17:25:52
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Ciao a tutti,
io sono alle prime esperienze con l'NGS e ho un problema nell'analisi dei dati.
Nella prima corsa ho ottenuto dei dati non tanto confortanti dato che dal report della corsa vedo che ho quasi il 100% delle reads allineate ma solo il 20% di queste appartengono al target.
Ora il mio dubbio è che questo non sia un problema di preparazione delle librerie ma piuttosto un problema di allineamento dei dati.
Secondo la vostra esperienza da cosa può dipendere o come ci si approccia in questi casi?
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 05 luglio 2017 : 20:43:42
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Ciao,
anch'io ho poca esperienza con la NGS, ma ne ho completata qualcuna.
Non ho capito cosa intendi con:
Citazione:
ho quasi il 100% delle reads allineate ma solo il 20% di queste appartengono al target.
E' una RNA seq? Stai allineando sul DNA?
P.S. che software usi? Galaxy? |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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bizio90
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 06 luglio 2017 : 09:55:41
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Ciao Domi,
effettivamente non ho dato molto informazioni, comunque è un enrichment panel gene custom.
Per ri-allineare le sequenze non ho usato programmi di bioinformatica perchè con questo tipo di kit viene fornito un file manifest.
Con il manifest il sequenziatore dovrebbe ri-allineare le sequenze secondo il mio pannello target.
Dai report dell'analisi però vedo che solo il 20% delle reads sequenziate è on-target.
Ora non so se questo dipende semplicemente dalla preparazione delle librerie, e quindi un errore dell'operatore, o se sia semplicemente un problema di ri-allinemento. Dubito che siano degli aspecifici dato l'elevato numero.
Dato che non ho grande esperienza neanche con la programmazione chiedo se per esperienza qualcuno avuto lo stesso problema. |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 06 luglio 2017 : 20:58:09
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Io ho fatto RNAseq, quindi non ho esperienza in questo.
Come viene fatto l'enrichment? Per PCR? L'avete fatta voi?
Puo essere che c'è stata una contaminazione avete amplificato altre cose che sono state sequenziate?!
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bizio90
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 10 luglio 2017 : 09:56:39
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In realtà è la prima prova con questo kit in più tra una multiplex e l'altra ho una fase di ibridazione con delle sonde complementari al mio target coniugate a beads magnetiche.
Ora non so più cosa pensare se sia un problema di aspecifico,di ri-allineamento delle reads, un problema di contaminazione o cattiva "bontà" del pannello stesso.
Oggi provo a vedere i fastq anche per capire dove sta l'errore e non rifarlo nella prossima preparazione delle librerie ;) |
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