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leviGFP
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 Inserito il - 30 marzo 2018 : 12:36:36
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Ciao a tutti, sono una studentessa di biotecnologie alle prese con un articolo di genetica. Ho due domande per voi:
1)nella produzione di un topo transgenico utilizzando CRISPR/CAS9, vengono utilizzate sia la GFP che la TdTomato per seguire l'espressione di CAS9 in cardiomiociti. Non capisco, però, per quale motivo vengano utilizzate entrambe.
Io suppongo che si tratti di un'operazione di immunofluorescenza. La GFP viene legata ad un anticorpo che riconosce un determinato antigene sul tessuto. però, richiede una precendente fase di fissaggio al tessuto con paraformalmide al 4% che potrebbe camuffare gli epitopi e quindi inficiare sul riconoscemento antigene - anticorpo. per questo motivo viene utilizzata la Tdtomato in alternativa, per avere una chance in più di seguire la reazione nel caso in cui la GFP non dovesse funzionare.
La pensate come me?  
2) quando viene utilizzata la tecnica CRISPR cas9, la cas9 induce il DSB e successivamente la cellula provvede a riparare il taglio tramite o ricombinazione omologa o NHEJ. -
Nel caso della ricombinazione omologa, il filamento di DNA templato che servirà per la ricombinazione, viene fornito sotto forma di vettore? non riesco a capire dove la cellula possa prendere il DNA da ricombinare.
vi allego anche l'articolo nel caso in cui vogliate leggerlo.
Grazie a chiunque proverà a darmi una mano.
Allegato:  PNAS-2016.pdf
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TOPO KO con crispr cas9
