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samu
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
 Inserito il - 12 aprile 2007 : 10:58:38
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Ciao!!
sto provando ad omogenizzare biopsie di polmoni umani per estrarci poi l'RNA (by Trizol)...trovo una ratio di 1.7-1.8 e poi nel gel 1% agarosio si vede che tutto l'RNA è degradato...come mai? uso l'ultra turrax t8 e mi ci vogliono 2-3 minuti (in ghiaccio) per una completa omogenizzazione...che sia lo strumento a dar problemi?? l'alternativa del pestello di vetro qualcuno di voi l'ha provata??
estrazioni di RNA da cellule in cultura invece nn danno problemi...
grazieee
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 12 aprile 2007 : 12:57:50
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Ciao!
Noi estraiamo RNA da muscolo, non avendo l'omogenizzatore congeliamo le biopsie a -80°C e le tagliamo con una lama da bisturi sterile in una petri altrettanto sterile...salvo i campioni già sfortunati di loro non abbiamo avuto mai problemi...
ma sei sicuro che le biopsie siano state conservate correttamente?
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Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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samu
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 12 aprile 2007 : 13:34:22
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Allora se non ho capito male tu tagli la biopsia in fettine sottili a secco e poi ci butti su il trizol per estrarre??
dopo l'intervento mettono il pezzetto in terreno completo e mi chiamano subito quindi non credo sia quello il problema....
GRAZIE!! |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 12 aprile 2007 : 14:47:22
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| Più che tagliarlo a fettine lo trituriamo tipo soffritto di cipolla in modo che poi la lisi col trizol sia più semplice |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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fortunato
Nuovo Arrivato
Prov.: Gorizia
Città: sagrado
2 Messaggi |
Inserito il - 12 aprile 2007 : 15:51:20
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Noi otteniamo RNA da biopsie intestinali, quindi tessuti rognosi di per sè. Noi utilizziamo il pestello e funziona benissimo.
Saluti. |
fortunato |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 12 aprile 2007 : 16:25:08
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Noi estraiamo RNA da vari tessuti, principalmente il tessuto adiposo, utilizzando appunto l'ultraturrax e non si hanno problemi a meno che il pezzo non abbia subito una degradazione. Il pezzo appena prelevato andrebbe subito in azoto liquido se devi andare ad analizzare l'RNA perchè "devi" fermare i processi di degradazione che comunque avvengono se anche lo metti in un terreno completo, alcuni utilizzano l'RNALater, ma a volte può dare dei problemi (so di alcuni che ne hanno avuti) in fase di estrazione. Se vuoi un consiglio prova almeno una volta a mettere il pezzo subito in azoto e vedrai che non avrai RNA tutto degradato.
E' normale che le cellule non si degradino perchè non è il passaggio con il potterizzatore che crea problemi, visto che di solito potterizzi in un mezzo che conserva l'RNA e nel contempo disgrega le cellule ( ad es. QIAZOL della QIAGEN), ma il tempo che intercorre tra il prelievo e l'omogenizzazione o il congelamento . Le cellule di solito vengono messe in un buffer e subito congelate a -80°C, difatti abbiamo notato che l'RNA delle cellule è sempre di ottima qualità ( mediante analisi al Bioanalyzer dell' Agilent), mentre per i tessuti, anche se io stessa ho congelato il pezzo e ti dico che dal prelievo al congelamento non son passati più di due minuti l'RNA variava a seconda del luogo in cui lo si prelevava sull'individuo, nel senso che c'è qualcosa che è legato al tipo di tessuto , considera che i nostri erano tutti prelievi di tessuto adiposo sottocutaneo di zone ipotrofiche, ipertrofiche e normali dello stesso addome. Immagina per un pezzo di polmone quanto tempo intercorre e cosa avviene dal prelievo all'analisi.
Un altro punto grigio secondo me è l'estrazione con il Trizol, so che per alcuni tessuti hai una resa più alta, ma se ci riesci è meglio utilizzare le colonnine, la resa magari può essere minore, ma la qualità è nettamente superiore.
In bocca al lupo. |
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samu
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2007 : 09:19:52
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GRAZIE MILLE A TUTTI
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2007 : 12:30:59
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| facci sapere.... |
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samu
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
 Inserito il - 14 maggio 2007 : 16:03:16
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nooo....non viene....help!!! con tutti gli altri tipi di tessuto sì, ma con polmone no..che faccio???
c'è qualche protocollo particolare di diverso dagli altri tessuti da seguire???
qualcuno di voi estrae da polmoni???
ciaooo |
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samu
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 16 maggio 2007 : 15:26:09
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FINALMENTE!!
non è una resa come quella delle singole cellule cmq l'RNA c'è!!!
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 18 maggio 2007 : 13:26:57
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E' normale avere una resa ed una qualità diversa di RNA del tessuto rispetto alle cellule.
E cosa hai fatto di diverso? E' di buona qualità?
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 18 maggio 2007 : 14:11:38
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Citazione:
E cosa hai fatto di diverso? E' di buona qualità?
Mi aggrego alla domanda di Cin...qual'è stato il trucco magico? |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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samu
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 21 maggio 2007 : 11:03:21
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Ho sminuzzato tanto tanto tanto in trizol e poi ho usato il pestello di vetro naturalmente tutto in ghiaccio!!!
segue protocollo by trizol..
ho ottenuto delle buone bande anche se un pò di sporcizia rimane...
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Discussione |
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omogenizzazione di un tessuto...
Didattica e Relazioni
