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FalenaAT
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2 Messaggi |
 Inserito il - 01 agosto 2018 : 13:11:16
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Salve,
ho bisogno assoluto di un aiuto.
Spero di star scrivendo nella sezione giusta, in caso contrario chiedo scusa. E chiedo scusa in anticipo anche per le molteplici richieste di aiuto.
Devo presentare un progetto ipotetico al professore del corso di imaging morfo funzionale.
Ho buttato giù il progetto (che non sto a spiegare nei dettagli, perché sarebbe inutile),
Mi trovo in difficoltà per quanto riguarda proprio la parte tecnica.
Allora, quello che avrei intenzione di andare a sviluppare sarebbe una marcatura in vivo nei neuroni di vespa, in particolare dei neuroni dei lobi frontali e del mushroom bodies, in seguito a stimoli olfattivi.
Utilizzo Fura-2AM come marcatore.
Ora, la prima domanda riguarda il tipo di microscopio da utilizzare. Ho letto che per Fura-2 è sconsigliabile utilizzare il confocale, si consiglia, invece, l’uso di un microscopio a fluorescenza. Non sono, però, riuscita a trovarne il motivo. Quindi, vi chiedo: perché non il confocale? Con il confocale diminuirei il rischio di photobleaching, sbaglio? E riuscirei anche a fare un’analisi in z-stack.
Si può analizzare in profondità anche con un microscopio a fluorescenza?
Altra questione riguarda obiettivo e ccd.
Pensavo di usare un obiettivo a immersione ad acqua (che mi permette di avere una NA maggiore).
Ho visto in letteratura che è stato utilizzato un 60x con 0.9 di apertura numerica e una ccd 640x480 px, con px size 9,9 #956;m.
Da qui, ho valutato se il criterio di Nyquist fosse soddisfatto:
la lunghezza d’onda (emessa da FURA-2 è 510 nm), quindi:
D(risoluzione) obiettivo: 510/2*0.9 = 283 nm= 0.28 #956;m --> per vedere i 2 punti in due pixel diversi, la px size della CCD deve essere almeno la metà: 0.28/2 = 0.14 #956;m
D CCD: con 60X: 9,9/60 = 0.16 #956;m --> ok, criterio di Nyquist soddisfatto (leggero sottocampionamento).
È giusto fino a qui?
Suggerite altro obiettivo e altra ccd?
Ora, per quanto riguarda l’acquisizione dell’immagine, ho fatto questi calcoli, possono andare bene? Qualcosa mi dice che mi sfugge qualche dettaglio importante….
Acquisisco in z-stack:
- voglio acuisire 100 piani (di 2 #956;m ciascuno)
- numero pixel totali 640x480 (quelli della ccd)
- DwellTime: 2 #956;s. È importante non stazionare molto su ogni pixel per evitare al massimo il fotodanneggiamento
Quanto tempo ci metto? n. tot pixel*pxDT*stack = 640*480*2 *100= circa 1 minuto
Per piano: 60/100= 4 sec
Per l’analisi temporale, invece, come posso fare? Mettiamo che voglia acquisire con un frame rate di 5Hz (5 immagini al secondo)
Che Dwell time posso utilizzare?
Uso tutta la camera? 640x480?
Successiva domanda. Ho visto, sempre in letteratura, che per avere la concentrazione di calcio posso applicare la seguente formula: [Ca]= (R-Rmin)/(Rmax-R) Sf*Kd
Dove:
R= è il ratio di Fura-2 340/380
Rmin: è il ratio in assenza di calcio
Rmax: è il ratio a saturazione dell’indicatore
Kd: costante di dissociazione (la [Ca] che serve per saturare il 50% dell’indicatore)
Cosa sarebbe, invece, Sf??
Poi, ho visto che per calcolare la Rmin e Rmax dovrei fare una misura di Fura-2 in contemporanea ad un patch clamp.
Quindi, potrei procedere in questo modo?
faccio patchclap in contemporanea con la misura con fura 2:
quando non c’è segnale elettrico: ho Rmin
quando invece, il segnale elettrico aumenta, ma la fluorescenza no vuol dire che l’indicatore è saturato, quindi ho Rmax
Come si procede? Io ho ipotizzato una procedura come segue (tramite whole cell):
utilizzo un capillare al quale applico un pressione negativa --> lo avvicino alla cellula e a questo punto applico una pressione positiva: il capillare aspira la membrana della cellula che si fora. A questo punto, ho il citoplasma della cellula in continuità con il capillare. Nel capillare è inserito un elettrodo con il quale faccio le misure. Fura-2 può essere inserito dal capillare stesso.
A quato punto, vedo tramite l’elettrodo quando non ho variazione di potenziale (faccio la misura senza dare alcuno stimolo alla vespa), illumino a 380 nm e poi a 340 nm --> 340/380 mi dovrebbe dare la Rmin?
Poi, stimolo la vespa e illumino di nuovo a 380 e 340 --> quando alla massimaintensità di fluorescenza a 340 anche il potenziale aumenta, dovrei aver raggiunto la saturazione dell’indicatore e, quindi, posso fare 340/380 per avere la Rmax, giusto?
Spero che qualcuno abbia del tempo per darmi una mano.
Grazie mille :)
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Imaging neuronale in vivo con Fura-2 e whole cell
