| Autore |
Discussione |
|
|
Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
 Inserito il - 14 aprile 2007 : 20:02:30
|
Ragazzi, nonostante io abbia cercato di chiarire i miei dubbi leggendo di tutto un po', non riesco a chiarirmi dei dubbi sul pulldown qndi vi chiedo aiuto Uno dei dubbi: la corsa su gel di poliacrillamide della proteina di fusione (tag+proteina di interesse) è sempre necessaria? Inoltre, come misuro poi l'interazione della mia proteina con qlla che vi si è legata?a parte il western...?so che ci sn altri metodi ma nn mi sn chiari!Ancora...cosa rende qsta tecnica così attendibile? Inoltre,so che se l'interazione della prot di interesse con i possibili interattori è transiente, il pulldown è difficoltoso! In qsto caso la tecnica del peptide array potrebbe essere più adatta? Grazie mille a chiunque cercherà almeno di risp
|
Ascoltami con gli occhi... |
|
|
|
|
Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
 Inserito il - 15 aprile 2007 : 09:46:27
|
Rileggendo il mio quesito di ieri mi sono resa conto che...forse perchè era tutto il giorno che cercavo di capirci qualcosa sul pulldown...ma cmq ho mescolato un po' troppo le carte... Se qualcuno avesse qualche link da consigliarmi in cui si espone questa tecnica in modo chiaro, con vantaggi e svantaggi...oppure se ha voglia di spiegarmelo lui... mi farebbe un gran piacere |
Ascoltami con gli occhi... |
 |
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
 Inserito il - 15 aprile 2007 : 13:26:09
|
Ciao Gst!
Detto in due parole:
Il pull-down assay è una tecnica per verificare l'interazione fra due proteine.
Si utilizza una proteina con un tag (ad es. GST, His6, biotina…) detta bait (esca) che deve “catturare” un'altra proteina prey (preda), che è quella in cui voglio verificare se ci sia interazione.
La proteina esca viene immobilizzata su un supporto (ad es. su una colonna di affinità), a secondo del tag utilizzato, e viene utilizzata per testare l’interazione con altre proteine.
La “proteina esca immobilizzata” viene messa a contatto con diverse proteine con cui si “sospetta” ci sia un’interazione.
Il complesso “proteina esca-proteina preda” che si forma viene poi staccato dal supporto di affinità e analizzato mediante SDS-PAGE e visualizzazione con tecniche come ad es. Coomassie, Silver Staining o Western blot.
Per risolvere i tuoi dubbi, mi sembra che qui sia spiegato tutto molto bene:
http://www.piercenet.com/Products/Browse.cfm?fldID=F3FD3612-415F-42A5-8922-736F9FDD36FB
|
|
|
|
Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2007 : 13:51:16
|
Grazie GFPina... il link che mi hai dato lo avevo già visto...ma il mio dubbio riguardava le interazioni transienti tra la proteina di interesse e la prey...!in qsto caso ad esempio per coimmunoprecipitazione l'interazione potrebbe nn vedersi, per durante l'analisi l'interazione spesso nn si vede in qnto la dissociazione del complesso proteina di fusione-prey è veloce!Con il pull-down si ha lo stesso problema, ma si può ovviare affinando la tecnica...da qnto ho letto sul link!Ma come?...ad esempio: il complesso prey prot di fusione potrebbe già rompersi durante l' Sds-page, visto che qsto prevede denaturazione delle proteine? se non si rompe durante l'sds-page, qli sono i passaggi più problematici?Grazie |
Ascoltami con gli occhi... |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2007 : 17:17:42
|
Non ho proprio chiarissima la tua domanda, provo a risponderti.
Il problema è per le interazioni transienti, e su questo siamo d'accordo!
Rispondendo prima alla fine della tua domanda:
Citazione:
Messaggio inserito da Gst
il complesso prey prot di fusione potrebbe già rompersi durante l' Sds-page, visto che qsto prevede denaturazione delle proteine? se non si rompe durante l'sds-page, qli sono i passaggi più problematici?Grazie
L'SDS-PAGE lo fai alla fine... il complesso "si rompe" perché denaturi (ma succede anche per le interazioni proteina-proteina stabili!!!). Comunque sia questo non comporta un problema, quando fai l'SDS-PAGE hai già "isolato" il tuo complesso...
mi spiego meglio:
vuoi vedere le interazioni di varie proteine con la proteina X(esca), ammettiamo che questa interagisca solo con la proteina B (e non con A, C e D), tu fai il pull-down... eluisci e alla fine nella provetta hai il complesso X-B, e basta!!! A, C e D non sono nella provetta perchè non legandosi ad X sono state "lavate" via!
A quel punto anche se denaturando X e B si staccano, comunque migrano entrambe sul gel e vedrai 2 bande (1 per X e 1 per B), quindi alla fine dell'analisi puoi dire che X interagisce con B.
I problemi ci possono essere prima, se le interazioni tra X e B sono transienti: B li lega ... ma poi durante i lavaggi si stacca... alla fine nella provetta ho solo X!!!
Rispondendo al resto:
Citazione:
Messaggio inserito da Gst
Con il pull-down si ha lo stesso problema, ma si può ovviare affinando la tecnica...da qnto ho letto sul link!Ma come?...
(Premetto che io non ho mai fatto un pull-dawn ma solo immunoprecipitazioni!)
Si possono aggiungere cofattori che rendono più stabili queste interazioni ... come spiegano qui:
http://www.funakoshi.co.jp/datasheet/PCC/21516.pdf
Citazione:
Transient: These interactions represent the most challenging to isolate and can be strong or weak in binding affinity, but are defined by their brief temporal interaction with other proteins. Transient interactions are common to enzymatic protein complexes that undergo dynamic rearrangements as the complex cycles through a particular biological process. A protein that transiently interacts with another protein or protein complex will often “dock” at a unique molecular interaction site. The recruited protein is held at this site only until it has performed its cognate enzymatic function after which it is allowed to recycle (deassemble from the complex) and await the next docking event. These transient interactions are frequently associated with NTP hydrolysis and, as such, the inclusion of NTP and non-hydrolyzable NTP analogs can be crucial to “trapping” a complex in a particular conformation conducive for the docking event under study. Other co-factors such as hormones and divalent cations can have similar effects on binding conformations depending on the system.
o aggiungere sostanze cross-linkanti che "bloccano" la proteina B quando si è legata a X!
ad es. guarda qui:
http://www.natureprotocols.com/2006/10/02/combination_of_chemical_crossl.php
|
|
|
|
Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2007 : 19:37:36
|
Grazie 1000 GFPinaaaaaaaa! era proprio quello che volevo sapere anche se nn so cm tu abbia fatto a capirlo...visto che la mia domanda nn era posta nel migliore dei modiGrazie ancora....a presto |
Ascoltami con gli occhi... |
|
|
|
tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2007 : 22:31:48
|
cosa rende qsta tecnica così attendibile?
................................................... |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2007 : 22:56:05
|
| Come ogni altra tecnica il fatto che sia stata validata da molti anni e che dia risultati coerenti con quelli di altre tecniche direi che la rendono attendibile. Cmq includere controlli positivi/negativi nell'esperimento è sempre cosa molto buona, anche se sai che la tecnica è attendibile. |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
| |
Discussione |
|
Pulldown assay
Didattica
