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Discussione |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
 Inserito il - 17 aprile 2007 : 21:16:18
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Ciao ragazzi! Ho un problema che mi affligge da un po' da porvi ! Sto facendo il tirocinio: mi occpupo di espressione e isolamento di proteine di fusione di domini proteici (GST-DominioSh2 nello specifico).Con gli Sh2 di alcune famiglie proteiche, qli SOCS e STAT su tutte,abbiamo avuto problemi nell'isolare la proteina: ne isolavamo poca e/o degradata (lo vedevamo correndo su gel di poliacrillammide).Facendo correre su gel il pellet,hanno visto che la proteina SEMBRA rimanere nel pellet,anzichè nel supernatante Come possiamo diminuire l'affinità di qsta col pellet e farla rimanere nel supernatante?HEEEEEELP....il mio tirocinio consisterà anche in qsto! grazie 1000 a chiunque riesca ad aiutarmi!
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Ascoltami con gli occhi... |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
 Inserito il - 17 aprile 2007 : 21:30:45
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| Se è associata alla membrana, potresti provare il metodo del carbonato di sodio. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
 Inserito il - 17 aprile 2007 : 21:37:06
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| Dionysos...nn ho mai sentito parlare di qsto metodo...sapresti indicarmi un protocollo?....un link....o altro? in ogni caso nn so se la mia proteina di fusione si associa alla membrana o altro...so solo che si trova nel pellet anzichè nel supernatante....ahimè...potrei provare lo stesso cn il metodo che mi hai indicato?Grazie 1000 per la celere risposta |
Ascoltami con gli occhi... |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 17 aprile 2007 : 21:49:50
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se la tua proteina la trovi nel pellet è presumibile che sia strettamente associata alla membrana (cosa dice la letteratura?) e quindi si potrebbe provare a fare un'estrazione di proteine dal pellet, e per questo esistono specifici buffer di lisi.
Si lavora il pellet con questo buffer e poi si procede come un anormale estrazione.
Oppure mi viene in mente che si potrebbe fare un'immunoprecipitazione: in questo modo risolvi il problema della quantità perchè in teoria tutto il campione che corri è costituito dalla tua proteina purificata, ma così non risolvi il problema della degradazione...a proposito di questo, magari sembra una domanda sciocca, ma nel buffer di estrazione usate gli inibitori delle proteasi?
-28 |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 17 aprile 2007 : 21:51:03
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| ma cerchi di produrre la proteina ricombinante o la vuoi isolare da cellule/tessuti che la esprimono normalmente? Come la purifichi? |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 17 aprile 2007 : 22:03:00
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Usiamo gli inibitori delle proteasi Ma infatti nn abbaimo problemi di degradazione con gli altri campioni!Iside sapresti anche indicarmi un link o altro dove trovare la composizione di questi buffer di lisi...e un protocollo per qsto tipo di estrazione?....sarebbe il top
Per rispondere ad Alexo invece, io cerco di produrre la proteina: è una proteina di fusione: Gst-Sh2 (gli sh2 sono domini proteici!utilizziamo sequenze di uomo o di mouse)e la faccio esprimere in e. coli BL21 rosetta!La purifico su biglie di glutatione safarosio 50%!sfrutto l'affinità della gst per il glutatione legato alle biglie di safarosio, che costituiscono una sorta di resina!del supernatante solo la prot di fusione si legherà alla resina!poi eluisco aggiungendo glutatione in eccesso e separando la mia proteina di fusione dalla resina!Spero di aver chiarito un po' le cose GRAZIE |
Ascoltami con gli occhi... |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 17 aprile 2007 : 22:16:41
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io lavoro (in parte) sugli Sh3
la tua prot non è solubile, almeno non nel modo in cui la tratti... ci sarà da lavorarci!
come fai l'estrazione? |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 17 aprile 2007 : 22:35:54
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Mi fa piacere Alexo...quindi puoi capirmiIo ho appena iniziato...sn una principiante ancoraIn ogni caso, tratto il pellet di batteri cn un buffer di lisi (50mM tris a pH8.0; 5mM EDTA; o,1% Triton X-100; 150mM NaCl)...aggiungo freschi inibitori delle proteasi e lisozima...incubo per 40' in ghiaccio, poi sonico 3 volte per 10 secondi e infine centrifugo per 20' a 4°C a 15000 rpm!Dal supernatante purifico la proteina come descritto nell'intervento poco sopraSpero fosse qsto ciò che volevi sapere...se no...chiedi pure!Hai sicuramente più esperienza di me...EhEh...ho da imparare e grazie |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 18 aprile 2007 : 12:49:07
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http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=30
qui trovi uno dei tanti buffer di lisi per la frazione insolubile. In letteratura ne trovi moltissimi, più o meno la composizione è sempre la stessa quello che cambia è in detergente utilizzato.
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tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
Inserito il - 18 aprile 2007 : 13:08:36
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quanto e' grande il tag
rispetto al frammento proteico
cambia vettore MBP, his, etc etc
prova baculovirus etc etc etc |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 18 aprile 2007 : 22:09:19
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Grazie Iside!Ho letto il protocollo..e...scusa la domanda che potrà sembrarti sciocca...ma se usassi il tris a pH 7.4 anzichè HEPES...sarebbe un problema?Se si, come posso fare l'HEPES? Se puoi aiutarmi ulteriormente rispondendo a qste domande grazie.
Per risp a tommaso invece, il mio tag è Gst: pesa ca 25 KDa...mentre la frazione proteica è un dominio Sh2, ca. 13 KDa. Il vettore che utilizzo è il plasmide p-gex!perchè mi consigli di cambiarlo?...Grazie dell' aiuto |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2007 : 14:17:11
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Sai che non sono sicura di saper rispondere alla tua domanda?
allora, il Tris è un tampone per il pH, lo mantiene stabile nel range 7.5 - 9.0. L'HEPES (leggo da wikipedia) "è utilizzato per proteggere soluzioni congelate di enzimi da variazioni di pH crio-indotte".
Ora, consideriamo che quando parti con un'estrazione proteica devi lavorare ad ogni passaggio in ghiaccio...forse per questo si usa l'HEPES??? tra l'altro (leggo sempre da wikipedia) l'HEPES "è una soluzione tampone organica largamente usata nelle colture cellulari per mantenere stabile il pH fisiologico". Quindi due in uno: soluzione tampone + soluzione crioprotettiva per enzimi.
Citazione:
Messaggio inserito da Gst
Se si, come posso fare l'HEPES?
In che senso?
C'è qualche motivo particolare per cui non vuoi usare l'HEPES?
In ogni caso aspettiamo che qualche altro collega ci dica anche la sua.
Se hai altre domande, chiedi pure
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 20 aprile 2007 : 00:14:13
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Noi usiamo l'HEPES come tampone in soluzioni fisiologiche ad es. per elettrofisiologia o Ca++ imaging.
Non credo che cambi molto fra Tris ed HEPES, a parte che l'HEPES costa un botto (~200 euro per mezzo Kg, contro i 50 del Tris) |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 21 aprile 2007 : 11:23:41
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Nessun preconcetto contro l' HEPES Iside...per caritàsolo che il tris lo facciamo noi in lab...so la composizione ed è più economico, come sottolinea chick80..mi sembra già un'ottima ragione,se fossero equivalenti.. visto qnto sn preziosi i fondi
In ogni caso per ora sto facendo delle mini-prove d'espressione: in un'aliquota della coltura batterica induco l'espressione della prot di fusione cn IPTG 0,1mM (anzichè 1mM..cm da protocollo), per 1h (anzichè 5h)e a diverse temperature: RT, 30°C e 37°C (anzichè 30°C soltatnto cm avevo fatto fino ad ora). Farò correre l'estratto ottenuto su gel di poliacrilammide, e farò correre anche il pellet(dopo averlo risospeso in modo opportuno): in qsto modo posso verificare in qle delle suddette condizioni sperimentali c'è una maggiore qntità di prot nel sopranatente e minore nel pellet! Magari in una delle suddette condizioni la prot,data la bassa induzione e il poco tempo..nn "fa in tempo" a formare aggregati e/o associarsi alla membrana per finire poi nel pelleto ALMENO LO SPERO! Che ne pensate?...Dite pure...senza pietàGrazie 1000 per la collaborazione, lunedì dovrei vedere i primi risultati,vi farò sapere ovviamente! |
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tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
Inserito il - 21 aprile 2007 : 19:44:12
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deve considerare il fatto che il tuo dominio
potrebbe non venire correttamente foldato
potrebbe essere che al tuo GST sia attaccata una coda non foldata
che fa aggregare il tutto e precipitarla.
La possibilita' di non riuscire ad overesprimere proteine solubili
e' maggiore nel caso tu usi sistemi procariotici per geni eucarioti etc etc
La soluzione al problema (magari ne esiste piu' d'una) la devi cercare sistematicamente, ossia provando tutto quello che puoi provare:
1- diverse combinazioni di ceppi e plasmidi diversi tag velocita' di
overespressione etc etc
2- sistemi eucarioti (baculovirus cellule CHO o simili)
3- purifichi il frammento insolubile tenendolo in soluzione con agenti cautropici
e tentando il refolding (mai provato penso difficilissimo)
se fai degli espression trials puoi provare anche a 18°C un mio amico
portava i batteri a meno di 10°C per una sua proteina espressione irrisoria e crescita battterica nulla ma aveva un ottimo sistema per saggira l'attivita' dell'enzima.
oppure puoi prima dell'induzione (aggiunta dell IPTG)
sottopore i batteri a cold shock (un tot di minuti in ghiaccio) o heat shock
(un tot a 42°C).Prova tutto quello che puoi provare e che hai a disposizione.
Per quanto riguarda i buffer di lisi/pH di utilizzo puo' darsi che contino, ma penso sia piu' rilevante il modo in cui estrai le proteine mantenimento del campione in ghiaccio evitare overheating durante la sonicazione etc etc.
in cristallografia si usano concentrazioni di proteina fino a 50mg/ml
dove l'unico buffer e' 10mM tris-HCl.
in definitiva, le cose facili sono già state scoperte tutte e quelle che restano da scoprire sono, purtroppo, molto difficili but....... do you really want to give up so easily?
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
 Inserito il - 22 aprile 2007 : 18:30:26
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Grazie Tommasomoro...per la sfilza di spunti che mi hai dato
La strada è lunga e tortuosa insomma... 
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2007 : 13:44:10
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| come è andata? |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2007 : 21:38:33
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Ciao Iside..e ciao a tutti gli altriCi sn piccole novae
Ho corso su gel di poliacrilammide i 2 campioni fatti fino ad ora(per ognuno ho caricato sia pellet che sopranatante alle diverse condizioni sperimentali, descritte in intervento precedente). Uno dei 2 ha avuto un incidente di percorso: ho deciso che il risultato nn è attendibile! L'altro mostra che la mia prot di fusione è, in tutte le condizioni, in maggiore qntità nel pellet, tranne che per espressione a RT (room temperature) per 1h cn induzione cn IPTG 0,1mM(in qsto caso SEMBRA essere in maggior qntità nel sopranatante).
Visto ciò, ho intenzione di procedere facendo esprimere la proteina di fusione a RT, per diversi intervalli di tempo (2h,3h,4h,e o.n.)e correrò di nuovo su gel per vedere cm si comporta in qsti casi.
Lo scopo è qllo di trovare la condizione in cui la proteina si esprime senza finire nel pellet...e si esprime a sufficienza da poter essere poi purificata!
Che ne dite?... Grazie dell' interessamento |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2007 : 00:15:48
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molto molto interessante.
tipico esempio di come nel nostro campo le idee si evolvono e vengono continuamente modificati i nostri progetti! Dovrai lavorarci un bel po', ma quando otterrai un risultato la soddisfazione sarà immensa.
in bocca al lupo e buon lavoro |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 26 aprile 2007 : 22:21:41
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CREPI il LUPOOOOOOOOO Isidee grazie! Vi terrò informati cmq...spero possano interessarvi le mie disavventure Ciao a presto |
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ampicillina
Nuovo Arrivato
Prov.: L'Aquila
Città: l'aquila
2 Messaggi |
Inserito il - 27 aprile 2007 : 09:56:59
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Come ti capisco....io ho il tuo problema da diversi mesi e ho provato di tutto: tamponi, temeperature di crescita, tempi di crescita, concentrazioni di induttore, plasmidi e cellule diverse!!! L'attività del mio enzima resta sempre scarsissima!
Ti sono vicino....CORAGGIO |
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Proteine nel pellet
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