procedimento per piastrare le cellule( help me)

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scient
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Inserito il - 30 aprile 2021 : 17:34:39

Buon pomeriggio volevo un p� ricordarmi come si piastrano le cellule (da un p� che non entro in lab). Ad esempio se effettuo la conta con la camera di thoma e conto ad esempio 152 e 148 e faccio la media ottengo 150. Lo moltiplico per 10^-4 otterr� un millione e mezzo per ml lo moltiplico per il volume totale ad esempio 6.5 ml ottengo il numero totale di cellule. A questo punto dovrei fare una proporzione per piastrare 120.000 cellule ed ottengo 80 microlitri.
1ml: 1.500.000 cell= xml : 120.000 quindi 80 microlitri che dovrei prelevare dalla mia soluzione. A questo punto come si prosegue si effettua la diluzione? Mi spiegate come procedere?Nella continuazione ho fatto (in passato) alcuni calcoli facendo la diluzione ma non ricordo perch� ho preso 2.4 ml si sospensione e 27.6 del terreno. Mi ricordate un p� il procedimento non lo ricordo perfettamente e vorrei colmare questo gap .Grazie.

sofychan
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101 Messaggi

Inserito il - 30 aprile 2021 : 21:50:16

Secondo me se ragioni in termini di cellule/mL (e in volumi piu' grandi) � un po' piu' pratico e teoricamente hai anche un errore piu' piccolo.
La tua sospensione � 1 500 000 cellule/mL.
Devi seminare 120000 cellule per pozzetto: quanto volume hai nel pozzetto?
Se ad esempio hai 1 mL per pozzetto, la concentrazione finale che vuoi avere di cellule/pozzetto sar� di 120000 cellule/1mL
Ne consegue che per avere la tua sospensione finale di 120000 cellule/mL (che userai per riempirti tutti i pozzetti della piastra) devi semplicemente diluire 12.5 volte la tua soluzione di 1 500 000 cellule/mL.
E qui � facile puoi prendere ad esempio per fare 30 mL a concentrazione finale 120000 cellule/mL: 2.4 mL (di soluzione 1 500 000 cellule/mL) + 27.6 mL di medium.

scient
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52 Messaggi

Inserito il - 01 maggio 2021 : 10:21:13

Ricapitolando allora come prima cosa si calcola il fattore di diluizione tra le cellule che ottenuto dalla conta/ cellule che voglio piastrare. Dopo aver troavato il fattore di diluizione 12.5 ne voglio calcolare il doppio sulla base del volume totale che desidero piastrare perch� mi servono ad esempio 30 ml totali per esperimento. A questo punto per calcolare il volume da prelevare conoscendo la concentrazione finale ed il volume finale / concentrazione iniziale ottengo 2.4 ml di sospensione cellulare ed il resto medium? Quindi pipetter� nel falcon 27.6 di terreno e 2.4 ml di cellule in sospensione in laboratorio?

sofychan
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101 Messaggi

Inserito il - 01 maggio 2021 : 11:01:38

Si', anche se non capisco bene cosa intendi per "volume finale / concentrazione iniziale ottengo 2.4 ml di sospensione cellulare"
Semplicemente volume finale (30 mL) / fattore di diluizione (12.5) e ottieni 2.4 mL di sospensione cellulare iniziale da diluire a volume finale 30 mL.

scient
Nuovo Arrivato

52 Messaggi

Inserito il - 02 maggio 2021 : 19:11:02

Io ricordavo di usare anche le proporzioni (quando � corretto utilizzarle) ? Io ricordavo (tanto tempo fa) che instauravo una proporzione Se ad esempio contassi 1.600.000 Cell per ml se moltiplico per sei ml che il volume della sospensione ottengo 9.600.000 cellule in 6 ml e volessi piastrare 200.000cell/pozzetto. Il volume totale in una mutiwell con 500 ul * 24= 12 ml e le cellule da piastrare 4.800.000
potrei fare una proporzione 6ml : 9.600.000 cell = xml: 4.800.000

xml : 4.800.000* 6/ 9.600.000 che � uguale a tre ml di sospensione e il resto medium? Mi ricordi un p� il procedimento? Scusami per la banalit� di esercizio ma devo colmare questo gap. Grazie

sofychan
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101 Messaggi

Inserito il - 03 maggio 2021 : 12:39:00

Si a livello teorico potresti usare anche una proporzione come quella.
Comunque nessuno in genere fa i conti in base al volume che ti servirebbe per riempire esattamente una piastra (nel tuo caso 12 mL). Perch� alla fine saresti sempre in difetto (considerando anche solo che l'FBS tende a fare bolle). Per questo a livello pratico puo' anche essere piu' comodo e veloce ragionare in forma di cellule/mL e "quanto devo diluire rispetto alla sospensione iniziale?"

scient
Nuovo Arrivato

52 Messaggi

Inserito il - 03 maggio 2021 : 13:28:06

Se ad esempio ho contato 1.500.000cell per ml e devo piastrare 150.000 in 500 microlitri
e' corretto dividere 1.500.000/150.000= 10 fattore di diluizione poi il volume finale considerando che ho 24 pozzetti ciascuno con 500 microlitri 12 ml ne preparo un p� di pi� ad esempio 20 ml e dividendolo per il fattore di diluizione ottengo 2 ml di sospensione cellulare e 18 di medium?

sofychan
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101 Messaggi

Inserito il - 03 maggio 2021 : 18:12:37

No, non puoi dividere mele per patate, il fattore di diluizione va ricavato dalle stesse unit� di concentrazione:

1500000 cell/mL / 300000 cell/mL(ho convertito 150.000 in 500 microlitri in cell/mL) = 5.

Poi, come hai detto tu, devi dividere 20 per 5, quindi 4 mL di sospensione iniziale e 16 di medium. In questo modo la tua sospensione finale � di 300000 cell/mL, quindi quando vai a metter 0.5 mL nel pozzetto avrai 150000 cellule.
Prova a rifletterci con calma.

scient
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52 Messaggi

Inserito il - 03 maggio 2021 : 18:39:11

Si hai ragione avevo pensato questa cosa vista che sono 500 microlitri. Grazie

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