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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
 Inserito il - 04 maggio 2007 : 23:49:24
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Dopo la miniprep, è necessario il sequenziamento per determinare che si sia effetivamente amplificato il cDNA di interesse? Oppure si può procedere direttamente alla trasfezione?
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moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 05 maggio 2007 : 12:58:19
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| Premesso che non ho mai transfettato perchè lavoro solo con coli e lievito mi verrebbe da risponderti che il sequenziamento è d'obbligo.Senza perderesti solo tempo e materiale,credo.O no? |
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 05 maggio 2007 : 13:14:22
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Quindi se io devo fare un esperimento che prevede:
1)Estrazione RNA
2)Sintesi di uno specifico cDNA
3)Inserzione di questo cDNA in un vettore di espressione eucariotico, quindi clonaggio seguito da miniprep
4)Trasfezione
Il sequenziamento dovrò farlo dopo la fase 2 per accertarmi che il prodotto di PCR sia giusto ed anche dopo la miniprep?
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moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 05 maggio 2007 : 14:10:16
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| Io sequenzierei dopo aver amplificato,quindi dopo le miniprep.E' quello che faccio normalmente con i plasmidi. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 05 maggio 2007 : 16:07:23
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Sì, anche dalle mie parte è d'obbligo sequenziare DOPO aver clonato (amplificato) il frammento cDNA
d'interesse. Tieni conto che la transfezione (e ciò che segue: processi di purificazione dell'eventuale
prodotto espresso) è un procedimento costoso e anche abb faticoso  E' inutile intraprenderlo
se prima non sei quantomeno sicuro al 100% che il DNA sia quello che vuoi tu (visto che perfino
con questa certezza in mano potresti incappare in non pochi problemi d'espressione:  garantisco!). |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 05 maggio 2007 : 18:07:41
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Ok quindi bisogna sequenziare prima di iniziare la trasfezione.
Invece se io non avessi neanche il cDNA nel vettore, prima di fare la ligasi cDNA e Vettore, devo comunque sequenziare il cDNA ottenuto con la PCR, prima di clonarlo? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 maggio 2007 : 21:44:35
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Beh non "devi" farlo per forza!!!
In genere come hanno detto moonycinzia e Dionysos si sequenzia il DNA plasmidico ottenuto dopo la mini prep (questo anche per verificare quali cloni abbiamo il vettore corretto), se però vuoi sequenziare anche il tuo cDNA nessuno te lo vieta, ma non è "necassario".
In genere si utilizzano primers specifici per il cDNA e una polimerasi proof reading e non ci dovrebbero essere errori nella PCR. |
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Miniprep e sequenziamento
Didattica
