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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
 Inserito il - 05 dicembre 2004 : 17:22:03
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Salve a tutti.
Chi mi sa dare un protocollo per estrarre il DNA mitocondriale? Ancora meglio se il tessuto di partenza è sangue.
Grazie mille
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Farah |
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Daria
Nuovo Arrivato
Prov.: Sassari
Città: Sassari
5 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2004 : 18:25:45
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Ciao, spero di esserti utile. Il buffer che ti nomino è da utilizzarsi in rapporto 1:10 rispetto al peso del campione (es: 50mg campione-0,5ml buffer):
Buffer di lisi:
-Tris HCl pH8 100mM
-EDTA 5mM
-SDS 0,2%
-NaCl 200mM
Protocollo:
1- Sminuzzamento del campione
2- Pesare 50mg di campione
3- Aggiungere 500 ul di buffer di lisi (1:10 col campione)
4-Aggiungere 20ul di proteinasi K (1mg/ml concentrazione finale)
5- Passare al vortex
6- Metter ad agitare a 55°C (over night)
7- Vortexare, valutare se i pezzi sono sciolti
8- Centrifugare a 14000 rpm x 10 min.
9- metter in nuove eppendorf 500 ul di alcool isopropilico
10- Aggiungere all'alcool il surnatante della centrifugazione (vedi sopra)
11- Agitare (su e giuù con le dita), appare la medusa di DNA
12-metter in freezer per 10 min
13- Metter in centrifuga (senza agitare) a 14000 rpm per 10 min
14- Eliminare il surnatante
15- Aggiungere etanolo al 70% circa 200ul (q.b. per corire il pellet)
16- picchettare leggermente (non vortexare)
17- centrifugare a 14000 rpm 10 min
18- eliminare il surnatante
19- Far asciugar bene all'aria (deve evaporare tutto l'alcool)
20- Risospendere in acqua distillata
Buon Lavoro, fammi sapere come va.
Io lavoro con il mitocondriale ed utilizzo questo protocollo. |
Daria! |
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atreliu
Amministratore
Prov.: Milano
Città: Milano
2484 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2004 : 12:11:54
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Wow!
Fantastico Daria, complimenti per la velocità e l'inserimento di questo protocollo che sarà utile a molti. |
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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 13 dicembre 2004 : 08:08:13
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| Grazie mille Daria...ma partendo da sangue secondo te come posso adattare il protocollo? |
Farah |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 dicembre 2004 : 23:14:51
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Non l'ho mai fatto sul sangue, però a naso direi di prendere il campione, centrifugarlo, eliminare il surnatante e procedere con il punto 3 del protocollo (dovrai probabilmente riadattare i volumi ma dovresti farcela!
nICO |
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