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michela
Nuovo Arrivato
Prov.: Reggio Emilia
23 Messaggi |
 Inserito il - 16 dicembre 2004 : 13:06:20
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ciao a tutti!
qualcuno di voi sa dirmi se un trattamento troppo intenso con DNAsi può degradare anche l'rna?
E, amplificando RNA con primer intronici, che probabilità ho di non avere amplificato (ossia, non avrei bisogno di fare il trattamento... )
grazie!
M.
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2004 : 19:08:21
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ciao!
quale trattamento? Stai cercando di estrarre RNA? |
Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-) |
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michela
Nuovo Arrivato
Prov.: Reggio Emilia
23 Messaggi |
Inserito il - 17 dicembre 2004 : 10:38:15
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Hai ragione, non mi sono spiegata molto bene.
L'rna l'ho gia estratto da muscolo scheletrico, devo trattarlo con dnasi prima della retrotrascrizione.
Ho fatto un controllo su gel d'agarosio e non c'era più nulla dopo il trattamento!
Quindi ora il dubbio è se il trattamento è stato troppo intenso o se magari l'ho degradato durante la corsa...tu sai se questo è possibile? |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 17 dicembre 2004 : 16:30:21
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l'rna è delicatissimo....devi essere stra attenta (non dovresti neanke guardarlo!!! )e tutto il materiale dev'essere RNAsi free... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 dicembre 2004 : 23:21:12
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Credo che concentrazioni troppo alte di DNAsi possano anche attaccare l'RNA.
Io di solito uso 1 o al max 1.5 U di DNAsi per ogni microgrammo di RNA.
Personalmente ti sconsiglio di retrotrascrivere senza il trattamento con DNAsi... viene molto sporco, e non puoi essere sicura di cosa amplificherai dopo... (cioè, quando fai la PCR, se vedi una banda non puoi essere sicura che sia l'amplificato di un RT, magari è amplificato di DNA genomico...).
PS: come hai fatto a controllare su gel di agarosio dopo il trattamento??? Hai dell'RNA, non del DNA, è normale non vedere nulla!
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 18 dicembre 2004 : 11:31:22
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eheh lunedi ho un'esame su un laboratorio in cui abbiamo proprio estratto dell'RNA.
Noi non abbiamo usato DNAsi (considera però che era solo un laboratorio didattico), però per l'amplificazione abbiamo usato primer costruiti su due introni adiacenti.
Per controllare di aver estratto correttamente l'RNA puoi fare una elettroforesi su gel denaturante (per evitare che si formino strutt. secondarie): dovresti vedere soprattutto le due bande dell'rRNA 28S e 18S (con un po' di fortuna anche 5S).
Se durante l'estrazione il tuo RNA si è contaminato con RNAsi, dovresti vedere uno smear composto da tante piccole bande definite, perchè gli RNA ribosomiali vengono tagliati dalla RNAsi in frammenti di dimensioni specifiche.
Oppure l'RNA si può degradare anche in ambiente basico (nel qual caso vedresti uno smear); se invece nel tuo estratto sono rimaste altre proteine, dovresti vedere uno smear sopra l'rRNA 28S.
Forse puoi fare questo test anche dopo aver trattato con DNAsi...
Un altro controllo della purezza dell'RNA lo ottieni facendo due letture allo spettrofotometro, una a 260 ed una a 280: ti dovrebbe venire un rapporto superiore a 1,6 (l'ideale è 2.0..)
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michela
Nuovo Arrivato
Prov.: Reggio Emilia
23 Messaggi |
Inserito il - 18 dicembre 2004 : 18:48:04
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L'estrazione è andata a buon fine ne sono più che certa: ho quantificato allo spettrofotometro (R>2.0 in quasi tutti i campioni) e controllato su gel denaturante e non (agarosio 0.8%, e ti assicuro che le bande 28S e 18S le vedo!) anche dopo il trattamento, proprio perchè avevo il dubbio che si fosse degradato l'estratto.
A questo punto credo proprio che 1U/microlitro consigliata sia troppo a meno che non abbia qualcosa di inquinato...e in quel caso allegria!
Proverò a diminuire la dose lunedì, grazie a tutti per ora!!!
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biotech
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
170 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2004 : 18:58:09
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| he protocollo hai usato: io l'ho estratto con "Promega": l'RNA è venuto molto puro (controllato allo spettrofotometro) però era troppo poco. Ora non so che fine abbia fatto, perchè era troppo poco per poter effettuare una trascrizione inversa per il microarray (veramente era al limite, però si è preferito riestrarlo). |
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michela
Nuovo Arrivato
Prov.: Reggio Emilia
23 Messaggi |
Inserito il - 20 dicembre 2004 : 13:27:48
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HO estratto con TRIZOL e ho ottenuto delle buone rese!
Da che tessuto hai estratto?
Questo RNA mi servirà per SSH ma non è esluso che lo utilizzeroò anche per i microarray.
Quanto ne occorre per la tua analisi?
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biotech
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
170 Messaggi |
Inserito il - 20 dicembre 2004 : 15:57:36
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La nuova estrazione l'ho fatta con il TRIZOL e ne è veramente tanto (in raltà non l'ho fatta io perchè quel giorno avevo l'influenza  ).
Non l'ho estratto da tessuto, ma da cellule in coltura: si tratta di RBL le conosci? Sono mastociti di ratto.
Normalmente si raccolgono dal surnatante 50 microlitri: poi si legge allo spettrofotometro quanti microgrammi/ml si ottengono. Io con l'estrazione del TRIZOL ne ho ottenuti da un minimo di 800 ad oltre 2000. Mentre con il PROMEGA ero arrivata a 200 al massimo.
Comunque per il microarray si può partire da 5 fino a 20 microgrammi di RNA. |
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michela
Nuovo Arrivato
Prov.: Reggio Emilia
23 Messaggi |
Inserito il - 21 dicembre 2004 : 17:58:18
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non ho mai estratto da cellule, comunque l'estrazione con trizol fornisce buoni risultati di regola.
alla fine ho fatto diverse prove con la dNAsi, sono arrivata a trattare circa 5 microgrammi di rna con 1 sola unità di dnasi ma ho ancora notevoli perdite e non in modo omogeneo tra l'altro.
escludo quindi un inquinamento di qualche reagente, piccola consolazione...
domani calerò ulterirmente e vedrò che fare... mah...
saluti!
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degradazione rna
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