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Autore

Discussione

marcotrafficante
Nuovo Arrivato

2 Messaggi

Inserito il - 31 maggio 2007 : 16:21:38

salve a tutti vorrei sapere come posso fare a vedere se un inserto � enrtato nel vettore. nn posso usare la digestione con gli enzimi utilizzati per il clonaggio poich� l'inserto � talmente piccolo ispetto all'intero costrutto che poi su gel non lo vedo. per limiti tecnici non posso usare nemmeno la PCR. esiste qualche altra metodica in grado di dirmi se questo frammento � entrato nel vettore? vi prego aiutatemi
by un biologo disperato

biomol
Nuovo Arrivato

65 Messaggi

Inserito il - 31 maggio 2007 : 16:41:11

scusa non puoi provare a fare sequenza?tanto se conosci il tuo costrutto...
in bocca al lupo

valia
Moderatore

Prov.: UK

1001 Messaggi

Inserito il - 31 maggio 2007 : 18:07:39

Oppure potresti controllare se la tua mini sequenza contiene sequenze di enzimi di restrizione. Se si, basta digerire il tuo costrutto e il plasmide vuoto e vedere se il patttern di bande che ottieni e' diverso, e se lo e', vedere se e' compatibile con le tue previsioni.

Dulbecco
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Citt�: roma

9 Messaggi

Inserito il - 02 giugno 2007 : 19:22:59

dovresti sequenziarlo...ma � strano che non puoi utilizzare siti di restrizione, come lo hai inserito?ma quanto � piccolo? io ho clonato un gene di 70 bp e riuscivo a vederlo sia con il gel al 2% d'agarosio che con la pcr. maaaa cmq � stranooo.buona fortuna...

LUCIA14976
Nuovo Arrivato

20 Messaggi

Inserito il - 03 giugno 2007 : 23:21:50

Se vuoi risolvere il problema prima di fare le sequenze, secondo me puoi far correre le tue digestioni o le tue PCR in parallelo con quelle fatte su un plasmide sicuramente vuoto (es. quello di controllo che spesso danno nei kit oppure inoculi o purifichi una colonia blu). Anche se il frammento � molto corto es. 20, 30 pb dopo una corsa al 2% anche se lo standard non ti aiuta a sapere la lunghezza esatta, dovresti riuscire a disciminare quelli leggermente pi� lunghi dal tuo controllo. Ciao e in bocca al lupo