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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
 Inserito il - 09 giugno 2007 : 11:29:37
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Al termine del western blotting, dopo lo sviluppo della lastra, ho notato delle regioni bianche sulla lastra, anche se era presente comunque la banda relativa alla proteina d'interesse.
La presenza di quelle regioni bianche a mio avviso potrebbe essere determinata dai seguenti fattori:
1) Eccesso di anticorpo primario
2) Problemi nella corsa elettroforetica
3) Trasferimento non eccellente su membrana
Ho utilizzato un anticorpo sperimentale che quindi non è il massimo, su campioni proteici di tessuto.
La presenza inoltre di bande a basso peso molecolare, potrebbe essere dovuta all'anticorpo non proprio specifico contro la proteina di interesse oppure magari al collagene presente nei campioni di tessuto corsi su gel?
Cosa ne pensate?
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2007 : 12:11:23
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| Fissaggio troppo breve. La prossima volta mantienila più tempo nel liquido fixer. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2007 : 19:11:41
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| Non avevo pensato al fissaggio, perchè le zone bianche sono verso il centro della lastra e non presenti in tutta la regione che ha aderito al filtro. La prossima volta proverò comunque anche a tenere di più nel liquido di fissaggio. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2007 : 11:39:49
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| Si uso ECL dell'Amersham. |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2007 : 12:35:07
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io per evitare macchie sulle lastre quando espongo l'ECL tengo la membrana in movimento, cioè ci metto l'ECL e poi la appoggio su una basculante a forte velocità. Il movimento durante l'esposizione minimizza le macchie. prova
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2007 : 12:37:15
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| Allora potrebbe semplicemente un problema di quando hai messo l'ECL. La soluzione più veloce sarebbe rifare il blotting e vedere cosa viene fuori. |
Sei un nuovo arrivato?
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2007 : 14:47:29
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Sono d'accordo.
Se il problema si ripete, anche distribuendo bene l'ECL e fissandola per molto tempo,
allora forse è il caso di ripreparare la soluzione fixer. In genere è colpa del fissaggio
quando nella lastra trovi zone bianche o pallide (tipo 'annebbiate'). |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2007 : 10:00:47
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Citazione:
Si uso ECL dell'Amersham.
hai provato a guardare la data di scadenza? a noi è successa una cosa simile con l'ecl dell'amersham scaduto (da un paio di settimane)...da quel momento siamo passati al western pico della pierce |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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