|
Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
 Inserito il - 12 giugno 2007 : 13:09:55
|
Preso dalle dispense di Biologia Molecolare della mia prof:
FAGO lgt11: utile nella strategia dell’inserzione e quindi nella costruzione di librerie a cDNA (può contenere frammenti di 6-8 kb).La sequenza inserita potrà essere espressa come proteina all’interno del batterio. Il ricombinante quindi verrà riconosciuto tramite un anticorpo.
Il cDNA viene inserito a livello del sito per Eco RI immediatamente a valle dell’inizio del gene lacZ che codifica per la beta-galattosidasi. In presenza di IPTG la sequenza genica LacZ-cDNA inserito del ricombinante viene espressa sottoforma di una proteina chimerica o di fusione che presenta l’estremità N-terminale della beta-galattosidasi e il resto della proteina clonata. Questa proteina chimerica non avrà l’attività galattosidica e quindi con il metodo della colorazione con x-gal potremo evidenziare i ricombinanti. Successivamente per evidenziare la proteina di interesse si procederà con un’analisi di western blotting dei ricombinanti (colonie bianche ) che sarà sviluppato con un anticorpo specifico diretto contro la proteina stessa.
Praticamente il vettore è stato ingegnerizzato per avere un sito di restrizione per EcoRI all'interno del gene per una B-galattosidasi. Se l'inserzione del gene di tuo interesse è avvenuta, lo puoi constatare andando a piastrare il fago su una patina di batteri sensibili (mi sembra che anche E.Coli è sensibile) con X-Gal. Le placche di lisi saranno blu dove non è avvenuta l'inserzione perché ci sarà una B-galattosidasi funzionante, mentre saranno incolore dove è avvenuta l'inserzione.
Per il vettore gt10, che non è un vettore di espressione, ma un semplice vettore di inserzione, il sito per EcoRI si trova all'interno del gene che codifica per il repressore che mantiene il fago nello stato di lisogenia. Se l'inserzione avviene avrai un repressore non funzionante e quindi l'entrata istantanea del fago nello stato litico con la conseguente formazione di placche. Per marcare i risultati puoi usare dei ceppi batterici hfl (high frequency of lysogenization), in cui il fago senza l'inserto entrerà nello stato di lisogenia molto più efficientemente. Il fago con l'inserto invece non riuscendo ad esprimere un repressore funzionale entrerà sempre e comunque nello stato litico, però usando gli hfl hai una maggiore certezza che le placche si sono formate solo dai fagi con l'inserto. |
 
 |
 |
|
vettori di clonaggio
Relazioni
Inserito il - 12 giugno 2007 : 12:05:08
