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trompso
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: palermo
9 Messaggi |
 Inserito il - 17 giugno 2007 : 13:41:11
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ho un paziente con la proteina alfa-gal che non funziona
ho sequenziato i 7 esoni del gene e sono tutti wt.
mi concentro dunque sugli introni e tramite rt-pcr vedo che
l'introne 4 ha un'inserzione di circa 60 bp.
è possibile che sia avvenuto uno splicing alternativo che abbia
mantenuto inalterata la struttura esonica, ma che abbia compromesso
la struttura della proteina?
se sì come?
grazie
sergio
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Enrico Ghezzi morirà in ritardo rispetto alla sua effettiva morte |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2007 : 13:56:09
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Se l'inserzione di 60 bp contiene un sito di splicing quello che potrebbe succedere è questo:
wild-type (S=sito di splicing)
....-----S[esone4]S---------------S[esone5]S--------....
inserzione
....-----S[esone4]S--------S---------S[esone5]S--------.....
Il wild type darà:
[esone4][esone5]
Quello mutato darà:
[esone4]---------S[esone5]
Se così fosse la proteina però dovrebbe pesare più del normale. |
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trompso
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: palermo
9 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2007 : 14:13:00
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grazie tante.
ti spiego meglio.
ho retrotrascritto una regione alla giunzione fra ex4 ed ex 5.
il cDNA ad essa corrispondente è stato fatto migrare in acrilammide.
mi sono spuntate due bande.
una della lungezza aspettata e una di circa 60 bp più pesante.
in base a questi dati posso dunque dire di essere di fornte ad un evento di splicing alternativo?
grazie e scusate per l'inistenza.
sergio |
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dallolio_gm
Moderatore
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2445 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2007 : 14:20:34
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Wow interessante!
Quindi tu Chick dici che si potrebbe trattare di un caso di Intron Retention?
Io non sono molto pratico di tecniche di laboratorio: per favore Trompso (benvenuto nel forum) potresti spiegarmi bene cosa sequenzi e in che modo?
Potrebbe trattarsi di una mutazione nei siti di regolazione dello splicing: che magari potrebbe portare ad uno switch nella popolazione verso una isoforma di splicing non funzionale, che non riesci a sequenziare perché degradata nel nucleo o in uno stadio precoce.
Spiego meglio: in seguito ad una mutazione dei siti di splicing vengono prodotte due isoforme contemporanemante, per esempio in percentuali del 20% e dell'80%.
L'isoforma che viene prodotta più frequentemente (quella 80%) non é funzionale, quindi viene degradata immediatamente, e non riesci ad osservarla quando sequenzi: però la frequenza dell'isoforma wt viene ridotta e quindi prodotta in quantità sub-ottimali.
Oppure, potrebbe trattarsi di una mutazione che ne influenza la regolazione facendo in modo che venga espressa in un momento dello sviluppo diverso o in un tessuto sbagliato.
Potrebbe trattarsi di una storia di questo tipo: o magari, la mutazione é in un altro gene, o c'è qualche altro tipo di problema. |
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trompso
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: palermo
9 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2007 : 14:29:06
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scusate se ho dato informazioni un po' vaghe.
mi spego meglio.
c'è una malattia, la malattia di Fabry, in cui si ha la perdita della funzione del gene GLA (alfa-galattosidasi A).
io saggio su sangue l'attività enzimatica dell'alfa gal e se ha valori di attività inferiori alla norma, cerco la spiegazioni nella sequenza genica.
sequenzio dunque i 7 esoni che compongono il gene alla ricerca di mutazioni (se ne conoscono più di 300).
Accade però che soggetti con attività enzimatica bassa, non abbiano mutazioni negli esoni sequenziati.
quindi ho estratto l'rna totale di questi soggetti, e ho fatto rt pcr amplificando una regione a cavallo della giunzione fra gli esoni.
verifico l'amplificato in acrilammide e vedo che per la giunzione fra ex 4 e ex 5 vedo due bande. una prevista e una più pesante di 60 bp.
ho pensato dunque ad uno spliceing alternativo.
e volevo la vostra opinione.
sergio |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2007 : 14:58:19
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La mia era solo un'ipotesi, ovviamente. Una cosa che si potrebbe fare è vedere cosa c'è in quelle 60 bp. Se guarda caso c'è una sequenza regolatrice dello splicing allora si potrebbe fare qualche ipotesi a riguardo.
Hai la possibilità di fare un western blotting su di un estratto proteico del plasma e andare a guardare la alfa gal?
Le due bande potrebbero anche derivare da eterozigosi della mutazione direi.
Ma tu pensi ad uno splicing alternativo DOVUTO alla mutazione (es. come nel mio schemino di sopra) oppure ad una situazione che esiste normalmente ma che in questi soggetti è per qualche motivo malfunzionante? |
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trompso
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: palermo
9 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2007 : 15:14:25
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quella del western è un'ottima idea chick.
quello che però sto facendo io è:
-sto clonando il cdna ottenuo in un ta cloning per aumentarne la quantità.
-poi voglio seqenziare questa regione contenete le 60 bp in più.
secondo me queste 60bp che si trovano nel mRna che ho retrotrascritto sono la causa del malfunzionamento dell'alfa gal.
se per esempio sequenziandole mi accorgo che corrispondono ad una regione intronica posso parlare di splicing alternativo.
posso anche presuppore che questa regione in più che viene tradotta, possa inserire un codone di stop e quindi io che sequenzio i 7 esoni ho sette sequenze wt, ma la proteina a causa di quell'introne entrato di soppiatto nel messaggero e tradotto mi produca una proteina non funzionante.
o sbaglio?
sergio |
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
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trompso
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: palermo
9 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2007 : 16:15:08
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il fatto è che per sequenziare devo convincere il mio professore che è convinto che mi stia impuntando, ma di certo quelle 60 bp in più nel messaggero del paziente sono anomale.
Ricapitolando le possibilità sono:
- una mutazione intronica che causa un intron retention
- una mutazione che causa un donor/acceptor site alternativo.
comunque è plausibile che ci sia questo splicing alternativo anche se non è riportato in letteratura?
perchè questo succede solo a cavallo di ex4 e ex5 di 2 pazienti, mentre in soggetti controllo no.
ditemi che è pluasibile o divento pazzo
sergio |
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2007 : 16:19:39
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beh dando un'occhiata alle sequenze un intron retention é poco probabile, perché la distanza fra esone 4 e 5 é più grande di 60 bp.
Certo che é plausibile che l'isoforma non sia stata riportata, anzi é molto interessante. Vi viene a costare molto il sequenziamento?
Forse potresti provare ad amplificare con altri primer per vedere se non sono abbastanza specifici e amplificano qualcos'altro. |
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trompso
Nuovo Arrivato
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9 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2007 : 16:29:31
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beh il sequenziamento di per sè non ci costa molto.
ci rivolgiamo ad un service (la mwg): circa 12 euro a sequenza,ma il fatto è che non possiamo spedire a sequenziare solo 2 campioni visto che le s.s. sono una bella botta.
per questo ho retrotrascritto, perchè già avevamo i primers e i kit.
Comunque il mio prof dice che si vedrà più in là e lui pensa che nella sequenza intronica ci sia una mutazione che rende poco regolato lo splicing, anche se non capisco in pieno che vuol dire.
grazie mille dallolio e chick |
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2007 : 16:50:14
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Dimenticavo: per progettare i primers puoi usare la pagina di fast-db che ti avevo postato (http://www.fast-db.com/cgi-bin/main_page.pl?gene_id=12431), cliccando su 'In-silico PCR').
Stavo dando un'occhiata ai siti di splicing (http://tinyurl.com/34e8sp , o via EnsMart):
>hg17_knownGene_NM_000169_6 range=chrX:100461799-100461890 5'pad=0 3'pad=0 revComp=TRUE strand=- repeatMasking=none
GTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACTGGCAGAAGCATTGTG
TACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGCCCTTTCAAAAG
>hg17_knownGene_NM_000169_7 range=chrX:100460080-100461798 5'pad=0 3'pad=0 revComp=TRUE strand=- repeatMasking=none
gtgagatagtgagcccagaatccaatagaactgtactgatagatagaact
tgacaacaaaggaaaccaaggtctccttcaaagtccaacgttacttacta
tcatcctaccatctctcccaggttccaaccacttctcaccatccccactg
ctgtaattatagcctaagctaccatcacctggaaagtcatccttgtgtct
[...]
tcctatgtaattttgcagcttttaattttactaagaccattttagttctg
attatagaagtaaattaactttaagggatttcaagttatatggcctactt
ctgaagcaaacttcttacagtgaaaattcattataagggtttagacctcc
ttatggagacgttcaatctgtaaactcaagagaaggctacaagtgcctcc
tttaaactgttttcatctcacaaggatgttagtagaaagtaaacagaaga
gtcatatctgttttcacag
>hg17_knownGene_NM_000169_8 range=chrX:100459918-100460079 5'pad=0 3'pad=0 revComp=TRUE strand=- repeatMasking=none
CCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATCACTGGCGAAATTTTGC
TGACATTGATGATTCCTGGAAAAGTATAAAGAGTATCTTGGACTGGACAT
CTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGGGGTTGGAAT
GACCCAGATATG
mi sembrano abbastanza conservati (AG-gtaagt al 5', [ct]AG al 3', non vedo bene il branching point).
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spliceing alternativo
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