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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
 Inserito il - 19 giugno 2007 : 15:48:31
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A chi non è capitato di imparare dagli errori fatti?
Premetto che non ho mai avuto a che fare con le sequenze, ma ho cominciato all'inizio dell'anno quest'avventura.
Bè è un po' ( circa due mesi) che mi stavo scervellando a capire perchè la maggior parte delle mie sequenze da un certo momento son cominciate a venire male, nel senso che erano sporche e sempre dello stesso sporco anche se le mettevo su in momenti diversi ( per alcune sequenze non capivo però se lo sdoppiamento dei picchi era dovuto a mutazioni).
Allora ho cominciato a far prove su prove, a ridiluire i primers, ho controllato tutti i reagenti che non fossero contaminati oppure degradati, ho provato con i controlli negativi.
Purtroppo abbiamo solo due termociclatori, per cui usavo preferenzialmente uno, poi, nel momento in cui ho deciso di provare a vedere se era il termociclatore ho introdotto in quella seduta un'ulteriore variabile : quantità troppo bassa e/o alta di amplificato.
Bè alla fine ( anche se non ne sono certa) penso sia dovuto alla macchina da PCR, dovrò fare altre prove, ma il tempo stringe e le risposte vanno date.
Da quest'esperienza ho imparato molto, anche perchè me la sono dovuta sbrogliare da sola ( la mia capa è in maternità), ma spero proprio di non dover ripetere una cosa del genere: è decisamente logorante!!!!
A voi cosa è capitato? Magari anche gli altri possono imparare dai vostri errori......
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
 Inserito il - 19 giugno 2007 : 17:54:36
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beh cin, io tempo fa aprii un topic in un'altra sezioni in cui chiedevo se era fisiologico avere dei "momenti no"!
io mi occupo prevalentemente di biologia cellulare e biochimica e c'è stato un buon periodo in cui gli esperimenti di western blot erano una favola, sia dal punto di vista tecnico che dal punto di vista dei risultati ottenuti, nel senso che sulla base dei risultati abbiamo fondato le basi per un importante lavoro...però, ad un certo punto i western blot hanno cominciato a non venir più bene: dati discordanti, problemi di estrazione, lastre poco chiare...insomma, uno sfacelo.
Inutile dirti che mi sono abbattuta parecchio e ho ripetuto gli esperimenti un mare di volte...ripreparavo i temponi di estrazione, mi sono fatta prestare celle per elettroforesi diverse, ho comprato l'acrilamide nuova...risultato? zero!!! Passato un po' di tempo e dopo innumerevoli tentativi ho cominciato di nuovo ad avere risultati discreti, ma non sono mai tornata agli antichi splendori
E vuoi sapere la cosa più assurda? Io ancora oggi non so perchè sia successo!!!
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2007 : 23:52:01
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Beh, succede a tutti ed è normale sentirsi un po' abbattuti... ma si va avanti lo stesso!
L'ultima volta che mi è capitato ho praticamente buttato al vento 6 settimane di esposizione di una in-situ perchè avevo scambiato la sonda senso con l'antisenso. doh... |
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Mrselfdestruct
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2007 : 16:23:57
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Ragazzi non vi spiego quanto ho dovuto patire per mettere a punto una pcr qualche mese fa...
Gradienti di temperatura, scale di Mg, touchdown, 3 tipi diversi di Taq e rifacimenti su rifacimenti di primer senza ottenere niente!
Alla fine ce l'ho fatta aggiungendo DMSO e altri reagenti "inusali" per una pcr classica... Ma che pena!! |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2007 : 17:31:01
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Credo che una delle cose più belle del nostro lavoro sia proprio l'imprevedibilità...certo...poi ti girano quando una cosa che doveva venire non viene più ma sbattere le testa per capire cosa non funziona più non è una cosa stupenda (cause ambientali non da sottovalutare...soprattutto per biochimica e citogenetica secondo la mia piccola esperienza) o impazzire per far funzionare una cosa...datemi pure della psicopatica ma io lo trovo stupendo (molto di più che fare la lotta per le attrezzature col mio titolare come dicevo in un topic di qualche giorno fa)
Cmq...tornando alla domanda di cin...giusto per capire...voi avete il sequenziatore o mandate al cribi...a volte il problema può essere il capillare vecchio...
e...usi la premix dell'applied...perchè se quello che tu chiami sporco è una specie di picco che si sovrappone agli altri intorno alle 70bp è un difetto della chimica che stai usando...io devo scappare via ma se ne riparla domani |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 giugno 2007 : 20:28:40
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Cin non sai quante volte!!!
e poi un anno verso l'estate le PCR non funzionavano più, ho cambiato Taq primers... tutti i componenti della PCR, compresi i controlli e sono andata anche a provare il thermal cycler in un altro labo... niente! Tornata dalle vacanze tutto funzionava alla perfezione! Per fortuna però non dovevo dare risposte urgenti... altrimenti non so!
Però tutt'ora mi chiedo cosa possa essere stato!
Per non parlare degli errori che si fanno... sapessi quanti... ho pure invertito gli elettrodi e fatto migrare un gel per proteine al contrario, (è uscito tutto!) ma visto che non me ne sono accorta perché mi ero allontanata sono andata avanti nell'esperimento pensando che fosse migrato fino in fondo... solo dopo mi sono accorta che gli elettrodi nell'alimentatore erano invertiti!! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2007 : 15:09:54
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Anche a me è successa quella degli elettrodi, ancora adesso mi succede di dimenticarmi il gel mentre sta correndo !!!
Ma una cosa che non potrò mai dimenticare è stata quella delle H2O positive mentre stavo lavorando con il WNT, ho rifatto tante di quelle PCR, ero diventata una maniaca, mi cambiavo guanti, cambiavo confezione di punte, cambiavo tutti i reagenti e niente da fare, ho cambiato persino posto di lavoro, me ne sono andata in " bunker", dove venivano fatti i RIA, ma niente da fare, ogni tanto avevo queste acque positive.
Poi , un giorno, per caso, ho visto una mia collega che faceva la seconda parte del lavoro ( il sequenziamento), che apriva il freezer (dove io avevo le mie cose) con i guanti con cui aveva appena aperto le provette di amplificato oppure un'altra che rispondeva al telefono sempre con i guanti con i quali avevano appena aperto le provette di amplificati!!!!!
Mesi di lavoro...... soldi.....fatica...... stress!!!! tutto per cosa?
PER LA PIGRIZIA DI TOGLIERSI UN PAIO DI GUANTI!!!!
Citazione:
voi avete il sequenziatore o mandate al cribi...a volte il problema può essere il capillare vecchio...
Il sequenziatore era nuovissimo, direi appena arrivato, per cui prima pensavamo che fosse colpa del capillare vecchio, ma visto che venivano male anche su quello nuovo è stata la prima cosa che abbiamo escluso.
Adesso purtroppo non ho tempo, perchè mi rimane solo una settimana prima di andare in ferie, ma appena torno aprirò un topic per quelle sequenze venute male, con relative foto ( sempre se riesco a postarle....)
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2007 : 15:46:02
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| ok Cin!allora resto in attesa! |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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zio
Utente Junior
Città: Napoli (IRAQ)
120 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2007 : 17:02:07
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 una volta, mentre caricavo un gel al 3%, mi succedeva che appena pipettavo , nel pozzetto, l'ampl. compreso il colorante,il tutto spariva all'istante, non ho mai capito il perchè
a qualcuno sicuramente sarà già capitato!! |
zio |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2007 : 18:24:33
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Anche a me è successo... Non è che sparisse, ma usciva immediatamente dal pozzetto, anche se non c'erano bolle e il pozzetto era perfettamente perfetto!
Mah! |
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zio
Utente Junior
Città: Napoli (IRAQ)
120 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2007 : 18:51:01
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il mio svaniva non lo vedevi più!!! letteralmente rifiutato |
zio |
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2007 : 19:11:57
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In informatica ci sono delle buone procedure da seguire per ridurre questo tipo di problemi.
Per esempio, un buon programmatore spende la maggior parte del tempo a progettare unita' di test prima di scrivere un programma: per esempio, cerca di prevedere quali sarebbero gli effetti di un errore nei dati di input nel suo script, o di capire quali potrebbero essere gli errori di programmazione piu' probabili che li potrebbero venire fuori e a cosa porterebbero: cerca di scomporre il suo codice nella maniera piu' razionale (funzioni, classi, moduli, etc..) e testa i vari blocchi independentemente.
Un'altra buona pratica e' quella di schematizzare il lavoro che si intende fare, possibilmente prima di iniziare: in informatica il linguaggio di schematizzazione piu' diffuso si chiama UML, purtroppo per gli esperimenti di biologia non esiste niente di esattamente equivalente, a parte forse gli sforzi che stanno facendo su http://myexperiment.org e su alcuni articoli sparsi. |
Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-) |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2007 : 19:12:09
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Citazione:
Messaggio inserito da zio
una volta, mentre caricavo un gel al 3%, mi succedeva che appena pipettavo , nel pozzetto, l'ampl. compreso il colorante,il tutto spariva all'istante, non ho mai capito il perchè
a qualcuno sicuramente sarà già capitato!!
No questa mi manca!!!
Ma poi migrando il gel c'erano comunque le bande???
L'unica cosa che mi viene in mente è che fosse variato il ph del buffer e faceva virare il colorante (ad es. Blu di bromofenolo da blu a giallino)... anche se questo dovrebbe succedere a pH abbastanza acido!... non so?
Ma in laboratorio tutto è possibile!!! 
Citazione:
Messaggio inserito da cin
Poi , un giorno, per caso, ho visto una mia collega che faceva la seconda parte del lavoro ( il sequenziamento), che apriva il freezer (dove io avevo le mie cose) con i guanti con cui aveva appena aperto le provette di amplificato oppure un'altra che rispondeva al telefono sempre con i guanti con i quali avevano appena aperto le provette di amplificati!!!!!
Come ti capisco!!! Sai quanto ho litigato e litigo ancora per convincere tutti a tenere gli amplificati il più possibile lontani dal mio freezer con tutti i reagenti per PCR e a non portare "cose" nella stanza dove ci sono gli amplificati per poi ripirtarmele belle contaminate dove allestico RT o PCR!!! 
E' una dura lotta!!! |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2007 : 20:51:23
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
L'unica cosa che mi viene in mente è che fosse variato il ph del buffer e faceva virare il colorante (ad es. Blu di bromofenolo da blu a giallino)... anche se questo dovrebbe succedere a pH abbastanza acido!... non so?
Questa del viraggio di colore da blu a giallo è successo anche ad una mia collega davanti ai miei occhi: non abbiamo mai capito perchè! Stesso buffer di lisi, campioni estratti allo stesso modo dalla stessa mulltiwell, però mettendo il sample buffer uno dei campioni è diventato giallo! Manco a farlo apposta era il campione più importante!!!
Poi però la banda sulla lastra è venuta, molto fioca e quindi incomparabile.
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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zio
Utente Junior
Città: Napoli (IRAQ)
120 Messaggi |
Inserito il - 22 giugno 2007 : 21:06:17
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
[quote]Ma poi migrando il gel c'erano comunque le bande???
non ci ho provato, mi sembrava perseverare ed aggiungere al danno anche la beffa
ps: erano, manco a dirlo,delle prove urgenti!! |
zio |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2007 : 12:40:11
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Citazione:
una volta, mentre caricavo un gel al 3%, mi succedeva che appena pipettavo , nel pozzetto, l'ampl. compreso il colorante,il tutto spariva all'istante, non ho mai capito il perchè
Anche a me per fortuna non è mai capitato, e che Dio me ne scampi e liberi!!!
Però a proposito di gel c'è stato un periodo in cui non venivano, nel senso che io mettevo l'etidio, ma era come se non l'avessi messo. L'unica cosa che ho fatto è stata quella di lasciar perdere e a distanza di tempo hanno ripreso a funzionare. Più volte mi sono chiesta se per caso il gel era ancora così caldo che nel mettere l'etidio questo evaporava tutto.
Un'altra che mi viene in mente è quella accaduta ad un mio collega del Centro Trasfusionale: ad un certo punto nella loro analisi veloce per vedere il test di compatibilità le cose hanno cominciato a non funzionare,però in maniera random, non ricordo bene, ma del tipo che avveniva un'agglutinazione dove non doveva venire o viceversa. Sono diventati matti, fino a che hanno scoperto che la donna delle pulizie era cambiata e quella nuova al posto di spruzzare il detergente sullo straccio lo spruzzava sui banconi così andava a finire anche sui vetrini o sulle punte che loro utilizzavano per i test. Da quest'esperienza io non faccio pulire nulla sui banconi di biologia molecolare alle signore delle pulizie.
E ora .....buone vacanze a chi parte, io vado in quel di Francavilla a Mare, ci risentiremo dopo il 20.
Ciao a tutti e buon lavoro a chi resta! |
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