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veneremi
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: opera
4 Messaggi |
 Inserito il - 21 giugno 2007 : 14:01:30
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C'è qualcuno che conosce la tecnica dell'allele specific PCR? Uso primers che riconoscono una sequenza che non ha mai variabilità e, poi, mi procuro altri due primers capaci di legarsi alla stessa sequenza a meno di una singola base. So soltanto questo,ma non ho capito come funziona,nè quali sono i risultati.............AIUTO
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biolala
Nuovo Arrivato
Prov.: Pisa
Città: Pisa
16 Messaggi |
Inserito il - 21 giugno 2007 : 18:26:35
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ASO PCR usata per: genotipizzare una variazione genetica e soprattutto rivelare o identifica SNPs; rivelare se in un certo campione è presente o meno una certa variazione punti forme.
I primer ASO sono oligonucleotidi allele specifici e ne vengono disegnati in tutto 3: 2 forward diversi e un reverse comune. I forward hanno la stessa sequenza complementare al gene d'interesse eccetto che per l'ultimo nt al 3': un forward sarà complementare al wild-type, l'altro all'allele mutato.
Si assemblano 2 reazioni di PCR indipendenti con lo stesso DNA e identiche condizioni, molto stringenti, ma con i 2 primers forward diversi:
- se il DNA è wt (omozigote): ibriderà solo con uno dei 2 primers forward, quindi osserverai la banda solo nella PCR positiva (l'altra, con il forward "mutato", sarà negativo per il non appaiamento target/prime)
- se il DNA è mutato (omozigote): risulterà il contrario, cioè ibriderà solo col primer forward "mutato"
- se il DNA è eterozigote: entrambe le reazioni produranno un amoplificato di PCR, ma osserverai una banda meno intensa rispetto all'omozigote.
Spero di esserti stata utile
Buona giornata |
biolala |
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tween20
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2007 : 20:03:34
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Ciao, sono Tween20, biologo specializzando in genetica medica il prossimo ottobre. Faccio spessissimo ASO PCR e SSP-PCR e ti confermo in pieno la tecnica spiegata da biolala. Cmq ti consiglierei, inoltre, di inserire sempre e sopratutto nelle reazioni con primer fw "mutato" di ASO-PCR un controllo interno di qualità PCR e generare una multiplex con i 2 primers dedicati alla PCR allele specifica e 2 primers di controllo (primers che amplificano sempre)che ti permettano di verificare che, anche quando hai un segnale negativo nella PCR, questo dipende dal genotipo del tuo campione e non da altri eventuali problemi tecnici.
Ciao |
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