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Biotecgen
Utente Junior
Città: Napoli
191 Messaggi |
 Inserito il - 26 giugno 2007 : 19:45:11
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Salve a tutti. Sto preparando un esame di Terapia Genica del 1°anno specialistica in biotecnologie. In una lezione in cui ero assente, sono stati spiegati i lentivirus e tra gli accorgimenti per il loro miglioramento è stato spiegato il sistema Tet-off e Tet-on.
Su google ho trovato davvero molto poco e non ci ho capito una mazza.
Chi è così gentile da darmi qualche delucidazione.
Grazie 1000
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non esistono domande indiscrete...le risposte a volte lo sono. |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 26 giugno 2007 : 20:08:09
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Prof. Pastore?
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2007 : 01:06:36
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Allora, i sistemi tet-on e tet-off sono sistemi di espressione condizionali. Questo significa che quando trasformi una cellula con il gene X sotto il controllo di un sistema tet-on o tet-off puoi scegliere quando X viene espresso aggiungendo o meno tetraciclina (o suoi analoghi tipo la doxiciclina) al terreno.
Come funziona:
Tet-off
Il gene X è preceduto da un TRE (Tet responsive elements). La cellula viene anche trasfettata con la tetracycline-controlled transactivator protein (tTA), che in assenza di tetraciclina si lega a TRE e permette la trascrizione del gene. Se metti tetraciclina nel terreno (o se si parla di animali transgenici puoi iniettare la tetraciclina) tTA si stacca da TRE e il gene non è più trascritto. (quindi Tet "spegne" il gene, da cui il nome "tet-off")
Tet-on
Stessa cosa, ma invece di tTA c'è una reverse tetracycline-controlled transactivator protein, rtTA.
rtTA si lega a TRE in presenza di tetraciclina. Quindi se c'è Tet il gene viene trascritto.
Siccome in generale non è bello per le tue cellule starsene nella tetraciclina per troppo tempo, usi il sistema tet-off quando hai un gene che generalmente vuoi tenere "acceso", ma vuoi "spegnere" solo in alcune situazioni (es. un gene necessario per il normale funzionamento della cellula). Usi tet-on quando invece vuoi attivare un gene solo in alcune situazioni (es. perchè il prodotto del gene può essere tossico per la cellula).
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2007 : 15:27:37
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in aggiunta a quello che ha già detto chick, per il miglioramento dei vettori lentivirali si è pensato di costruire due vettori, di cui uno (siamo in un sistema Tet-OFF) esprime il tTa sotto un promotore PGK. Il promotore PGK serve perchè è un promotore forte. L'altro vettore invece porta due transgeni posizionati nell'ordine luciferasi (I° transgene)- IRES - GFP (II° trangene); i due geni reporter sono sotto il controllo di un promotore regolabile PTet1. Quindi l'espressione dei transgeni si verifica solo se tTa lega pTet1. In realtà potresti confonderti solo perchè sono due costrutti diversi, ma in realtà prova ad immaginare come se fosse un solo costrutto su cui hai un regolatore che lega un promotore dal quale poi parte la trascrizione del/dei gene/i (qui sono 2 perchè hai un IRES al centro).
costrutto 1: hPGK+tTA2s costrutto 2:PTet1-luciferase-IRES-GFP
Essendo reporter sia la luciferasi che la GFP si può seguire l'espressione del transgene nel tempo.
A questo punto si infettano le cellule con entrambi i vettori: poichè ti ricordo che questo è un Tet-OFF, senza doxiciclina si avrà trascrizione (monitori luciferase o GFP o entrambe e le trovi) mentre se somministri doxiciclina non si ha produzione delle proteine perchè dox lega il transattivatore che viene espresso sotto PGK cioè praticamente viene espresso sempre, in questo modo non si lega al promotore pTet1 e non si esprimono i transgeni
In realtà prima ti dicevo che si transfettano le cellule con i due costrutti però sono riusciti ad inserire tutto all'interno di un unico costrutto che contiene tutt(una transfezione rispetto a due).
Naturalmente tutto questo può essere considerato anche in un sistema Tet-ON.
come prima cosa occorre in transrepressore Tts e poi il promotore che regola l'espressione del transgene (prima era pTet1). Anche adesso ti occorrono 2 costrutti, in questo caso per il sistema Tet-ON non è stato ancora costruito un vettore che contenga tutto in un solo costrutto.
Il primo porta il transrepressore sotto il controllo del promotore del CMV (anche in questo caso, promotore costitutivo e forte, come per la PGK). l'altro costrutto invece porta il transgene sotto il controllo di un promotore regolato (transgene monitorabile, quindi un reporter, as esempio LacZ).
Il sistema è sempre lo stesso: con Dox viene attivato il transrepressore che va a legarsi sul promotore a monte del gene LacZ attivando la trascrizione. In assenza di dox non accade nulla.
Scusa se sono stata un po'lunga, spero però di essere stata abbastanza chiara.
-28
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2007 : 15:32:18
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ho dimenticato di dire un'ultima cosa: questi vettori sono tutti SIN di terza generazione perchè ormai i vettori di prima e SIN di seconda generazione non vengono quasi più usati.
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Biotecgen
Utente Junior
Città: Napoli
191 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2007 : 20:36:15
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ciao Iside.
Si l'esame è del prof.Pastore, anke se a quanto mi hanno detto questa lezione è stata spiegata da una sua assistente. Scommetto che anke tu sei iscritta a Biotecnologie, infatti hai un viso familiare!
Cmq grazie mille sia a te che a chick per le risposte esaurienti. Ma tu quest'esame lo hai già fatto ? come è stato? Io lo farò il 16 Luglio ma sono un pò preokkupato.
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2007 : 21:47:37
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Io ho fatto l'esame a febbraio e ti capisco se dici che sei preoccupato,perchè lo ero molto anche io!!! Io ho preso 34 allo scritto e poi l'orale l'ho sostenuto con pastore. In ogni caso le domande non sono difficili e l'importante è stare tranquillo e non confondersi in quel mare di programma!
Poi magari se vuoi qualche informazione più precisa non farti problemi a mandarmi un mp, anche perchè penso che siamo andati un po' off topic (sorry moderatori ).
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Biotecgen
Utente Junior
Città: Napoli
191 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2007 : 18:16:05
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Grazie mille iside
In bocca al lupo per tutto
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