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Pilu
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 06 luglio 2007 : 13:23:19
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Ragazzi ma cos'è il pyrosequencing?
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 06 luglio 2007 : 13:46:25
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http://en.wikipedia.org/wiki/Pyrosequencing
Ho anche una parte di un powerpoint che parla di questo, se ti interessa! |
 
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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Pilu
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 06 luglio 2007 : 16:14:46
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| se potessi passarmi i powerpoint avrei una visione più ampia.. grazie! |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 06 luglio 2007 : 21:34:42
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ah... il pirosequenziamento...
ecco qua....
Metodo del pirosequenziamento
Questo metodo si basa sul dosaggio del pirofosfato liberato in seguito all'attacco di un dNTP al filamento polimerizzato. Il pirosequenziamento è una tecnica per il sequenziamento del DNA e consta di 5 passaggi principali:
1. La sequenza da analizzare, dopo essere stata amplificata con la PCR, viene incubata come singola elica insieme agli enzimi DNA polimerasi, ATP solforilasi, luciferasi e apirasi e ai substrati adenosinsolfofosfato (ASP) e luciferina
2. Uno dei quattro dNTP è aggiunto alla reazione. La DNA polimerasi catalizza l'aggiunta di tale base solo se è complementare con il residuo del templato. In tal caso si ha concomitante liberazione di pirofosfato inorganico PPi
3. Il PPi così prodotto viene trasformato in ATP, ad opera della solforilasi e usando l'ASP come substrato. L'ATP ottenuto consente la conversione della luciferina ad ossiluciferina ad opera della luciferasi con produzione di un segnale luminoso che viene rilevato da un'apposita camera fotosensibile (CCD).
4. L'enzima apirasi degrada il dNTP che non è stato incorporato, e l'ATP prodotto dalla solforilasi. Solo quando la degradazione è terminata si aggiunge un secondo dNTP per far progredire la reazione di polimerizzazione (ritornando allo step 1)
5. Si aggiungono ciclicamente tutti e 4 i d(NTP) fino alla deduzione completa della sequenza
Il segnale luminoso prodotto ogni volta dalla luciferina viene registrato in un apposito "pirogramma". Il segnale sarà proporzionale all'ATP prodotto e quindi al nucleotide inglobato; un picco di intensità doppia, ad esempio, rileva che nello stesso ciclo sono stati inglobati 2 dNTP (ripetizione della stessa base sul temprato). Viceversa un segnale nullo indica che il dNTP aggiunto in quel ciclo non è complementare.
Si noti che non si può utilizzare l'ATP come dNTP da introdurre per la polimerizzazione, altrimenti non si riuscirebbe a capire se il segnale rilevato proviene da una corretta incorporazione del nucleotide o dall'attività intrinseca dell'ATP. Si utilizza in alternativa l'adenosina-tio-trifosfato, che è riconosciuta dalla DNA polimerasi come se fosse ATP, ma non dalla luciferasi.
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http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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Patrizio
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