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hepa1980
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 10 febbraio 2005 : 11:28:43
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Salve,
sto preparando l’esame di genetica molecolare , non mi è stato fornito nessun testo dal prof, ma solo una serie di articoli poco comprensibili…Mi servirebberoo un po’ d’informazioni
Cosa è il sistema cre- lox unito al recettore per i glucocorticoidi di mammifero per ottenere un sistema d’induzione trascrizionale condizionale????
Differenza tra topi transgenici chimerici e ko?
Come avviene il silenziamento post trascrizionale con RNA ds (riferimento al complesso RISC in Drosophila)??
Cosa si intende per RNA harpin?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 11 febbraio 2005 : 16:56:19
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Wow! Ci si potrebbe scrivere un libro...
Allora, andiamo x ordine:
1) Il sistema cre-lox sfrutta delle particolari sequenze del DNA del batteriofago P1 chiamate "loxP", sequenze che il virus normalmente usa come segnale di excisione x il suo DNA da quello dell'ospite. Cre è una ricombinasi, un enzima che riconosce le sequenze loxP, taglia il DNA in questi siti e lo circolarizza.
Supponi di voler studiare cosa succede eliminando una certa proteina ad es nel fegato. Potresti fare un topo KO, ma se la delezione completa di questa proteina in tutti i tessuti non è vitale questo non è possibile.
Puoi in questo caso creare un topo transgenico che abbia il tuo gene di interesse affiancato da sequenze loxP (tipo ---loxP-[GENE]-loxP---) e lo accoppi con un altro topo transgenico che ad es. esprima Cre sotto il controllo di un promotore specifico x il fegato (o x il tessuto che vuoi tu): la progenie (o meglio, parte della progenie) esprimerà Cre nel tessuto di interesse e quindi in quel tessuto il gene sarà exciso (perchè ha le sequenze loxP attorno). Negli altri tessuti le loxP ci sono, ma non c'è Cre, quindi il gene funziona normalmente.
Un'altra ipotesi è quella di mettere Cre sotto il controllo di un promotore sensibile alla dieta dell'animale (es. se non ricordo male, esistono promotori sensibili alle concentrazioni di Fe). In questo modo puoi decidere anche quando far excidere il gene.
b) La differenza tra animale KO e chimerico è molto semplice: l'animale ko manca totalmente di un gene, quello chimerico solo parzialmente.
Essenzialmente gli animali chimerici si usano x mutazioni letali, quando non è possibile avere un topo ko.
Per creare una chimera si impiantano staminali embrionali ko x il gene di interesse in una blastocisti normale.
La blastocisti viene quindi reimpiantata in una femmina pseudogravida: qualche animale della progenie avrà dei tessuti mancanti del gene. Questa tecnica è molto meno controllabile del sistema cre-lox, ovviamente.
c) Il silenziamento con RNA ds, più noto con il nome di RNA interference o RNA silencing (RNAi o siRNA) è un sistema abbastanza recente che permette di silenziare specificamente un gene utilizzando RNAds.
In pratica, le cellule eucariote contengono un sistema di nucleasi, chiamato RISC, che riconosce e distrugge RNAds (che fisiologicamente deriva ad es. da infezioni virali).
Si può sfruttare questo sistema iniettando una sequenza di RNAds complementare all'mRNA che si vuole silenziare.
La scelta della sequenza è molto importante e non è poi così banale... cmq una volta trovata la sequenza migliore si trasfettano le cellule con questo RNAds e questo porta all'attivazione di RISC che va quindi a distruggere anche l'mRNA con cui l'RNA inserito si è appaiato. L'effetto è però transiente (2-3 giorni max credo). Fai un po' una ricerca nel forum, c'erano stati già diversi messaggi sul siRNA.
d) Un RNA hairpin è semplicemente una struttura secondaria a "cappio" (tipo quelle dei tRNA) di un RNA.
Gli RNA hairpin si usano spesso al posto dei dsRNA x fare RNA silencing, perchè sono più stabili.
Se ad es fai un RNA con questa sequenza:
GAACGUUGGCnnnnnnnnnnnGCCAACGUUC
L'inizio e la fine si appaieranno e lasceranno un cappio formato dalle altre basi. La parte appaiata è essenzialmente RNA ds, anche se è formata da un solo filamento (quindi + stabile) e quindi attiva RISC.
Se vuoi altri chiarimenti chiedi pure!
nICO |
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hepa1980
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2005 : 01:13:59
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Ciaooooo chick80,
Grazie mille mi sei stato veramente d'aiuto, sicuramente mi verranno in mente ancora tante cos da chiederti. Continuo a sudiare e poi ti faccio sapere
Anzi esiste un libro di testo in italiano (non ho tanto tempo per tradurre articoli) su questi argmenti??
ANcora grazie
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legolas
Utente
Prov.: Lecce
Città: Trepuzzi
723 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2005 : 17:14:32
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| se chick non esistesse bisognerebbe inventarlo! |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2005 : 22:13:36
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forse il Gene VII di Lewis,che in inglese è già minimo alla VIII
o anche la nuova edizione del Lodish(5a se non ricordo male), che dubito sia già stata tradotta in italiano.
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biomagen
Nuovo Arrivato
Città: Barcellona
19 Messaggi |
Inserito il - 22 maggio 2005 : 22:17:41
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io sono stato due anni fa in Spagna e ho studiato su gene VII scritto in spagnolo. Ma noi italiani dobbiamo vergognarci per non averlo ancora tradotto o dobbiamo essere orgogliosi perché "capaci" di leggerlo in inglese?
lascio ai posteri l'ardua sentenza
ciao ciao |
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Bionda
Nuovo Arrivato
Prov.: Trapani
Città: partanna
1 Messaggi |
Inserito il - 14 luglio 2005 : 00:01:56
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| ciao,ho bisogno di qualche chiaramento sui sistemi fisici di trasferimento genico in particolare sui cannoni genici,elettroporazione e Intra-jet spero mi possiate aiutare............. un enorme grazie!!!!!!!!!! |
sciacca giusy |
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RNA world
Utente Junior
370 Messaggi |
Inserito il - 30 ottobre 2006 : 16:43:32
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
1) Il sistema cre-lox sfrutta delle particolari sequenze del DNA del batteriofago P1 chiamate "loxP", sequenze che il virus normalmente usa come segnale di excisione x il suo DNA da quello dell'ospite. Cre è una ricombinasi, un enzima che riconosce le sequenze loxP, taglia il DNA in questi siti e lo circolarizza.
Supponi di voler studiare cosa succede eliminando una certa proteina ad es nel fegato. Potresti fare un topo KO, ma se la delezione completa di questa proteina in tutti i tessuti non è vitale questo non è possibile.
Puoi in questo caso creare un topo transgenico che abbia il tuo gene di interesse affiancato da sequenze loxP (tipo ---loxP-[GENE]-loxP---) e lo accoppi con un altro topo transgenico che ad es. esprima Cre sotto il controllo di un promotore specifico x il fegato (o x il tessuto che vuoi tu): la progenie (o meglio, parte della progenie) esprimerà Cre nel tessuto di interesse e quindi in quel tessuto il gene sarà exciso (perchè ha le sequenze loxP attorno). Negli altri tessuti le loxP ci sono, ma non c'è Cre, quindi il gene funziona normalmente.
A proposito avrei una domanda...
se nn sbaglio la linea 1 (chiamiamola cosi') è Loxp-TG-Loxp, dove tg è il transgene di interesse. Questa linea nn esprime il transgene giusto? ed ha un fenotipo uguale al wt.
Nella linea 3, frutto di incrocio della 1 con la 2 (promotore tessuto specifico-cre) il gene TG non viene espresso da un certo tempo in poi ed in un certo tessuto.
Questo significa che prima nel tessuto di interesse tg era espresso?
Se si perchè nella linea 1 non è espresso?
Quindi si puo' riassumere che questo è un metodo per ottenere topi KO che altrimenti nn potrei ottenere perche' ci sono interferenze con embriogenesi?
Grazie! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 30 ottobre 2006 : 18:09:04
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Ciao RNA world!
Mi sa che manca un passaggio nel tuo ragionamento:
La "linea 1" è un topo transgenco fatto in modo che il gene di interesse (TG) sia contornato dalle sequenze LoxP ma è di fatto "uguale" al WT nel senso che il gene TG viene espresso esattamente come nel WT!
Il transgene quindi è espresso ma è lo stesso gene che hai nel WT, non un gene diverso che nel WT non c'è!
La differenza c'è quando incroci questo topo con il topo CRE, a questo punto il transgene viene exciso (nel tessuto in esame!) e hai un KO in quel tessuto perchè il gene non è più espresso!Citazione:
Messaggio inserito da RNA world
Quindi si puo' riassumere che questo è un metodo per ottenere topi KO che altrimenti nn potrei ottenere perche' ci sono interferenze con embriogenesi?
Scusa ma non ho capito la domanda?
Ti posso rispondere che è un sistema che usi per inattivare un gene solo in un determinato tessuto o solo in un determinato momento... ma non so se questa è la risposta alla tua domanda.
Spero di averti chiarito le idee!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 30 ottobre 2006 : 20:58:56
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Questa tecnica non è fatta in particolare per i geni letali, anche se vi si può adattare.
In quel caso dovresti mettere il gene sotto un controllo di un promotore inducibile con la dieta (es. promotori sensibili al ferro o al tamoxifene). Sono sistemi simili a quello che si fa su microorganismi con i sistemi tet-on e tet-off |
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RNA world
Utente Junior
370 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2006 : 09:33:05
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Quindi TG è semplicemente un gene che è normalmente presente nel genoma del topo, ma per renderlo KO in quel tessuto ad un certo tempo, è necessario fare un costrutto Loxp-TG-Loxp, cosi' viene tagliato poi da cre. Cioè la linea 1 serve solo per fare questo costrutto...ok.
Effettivamente adesso ha senso. io invece pensavo che TG, cioè transgene, fosse ad esempio un gene umano in topo, quindi nn riuscivo a capire quando veniva espresso.
Grazie, a presto. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2006 : 21:06:38
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| Beh, poi tecnicamente è un transgene... nel senso che per inserire i siti loxP di solito fai un KO del gene di interesse e un knock-in dello stesso gene con i siti loxP. |
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Shasa
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2007 : 15:49:38
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ciao ragazzi, per spiegare un esperimento che sfrutta il metodo cre-lox il prof ci ha dato una slide in cui c'è un costrutto con promotore,la GFP,il gene per la resistenza alla zeomicina,il sito Plox,la GFP,e un altro Plox (Ho cercato di riprodurlo come meglio ho potuto visto ke non posso copiare l'immagine;le freccette stanno ad indicare il verso)
P-> GFP-> ZEO P> GFP-> <P
_____________________________________________________
Quando agisce Cre cambia la direzione della seconda GFP (ma cre non dovrebbe escidere il segmento tra i due siti lox?)
P-> GFP-> ZEO P> <-GFP <P
_____________________________________________________
Poi si forma il dsGFP:
GFP-> ZEO <-GFP
secondo la slide questo dsRNA andrebbe a bloccare l'enzima DICER stesso. (Ma il dsRNA non dovrebbe attivare l'apparato biochimico di DICER e successivamente degradare l'RNA?)
sapete dove posso trovare più informazioni su questo esperimento?
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 16 settembre 2007 : 15:41:41
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Citazione:
Messaggio inserito da Shasa
ciao ragazzi, per spiegare un esperimento che sfrutta il metodo cre-lox il prof ci ha dato una slide in cui c'è un costrutto con promotore,la GFP,il gene per la resistenza alla zeomicina,il sito Plox,la GFP,e un altro Plox (Ho cercato di riprodurlo come meglio ho potuto visto ke non posso copiare l'immagine;le freccette stanno ad indicare il verso)
P-> GFP-> ZEO P> GFP-> <P
_____________________________________________________
Quando agisce Cre cambia la direzione della seconda GFP (ma cre non dovrebbe escidere il segmento tra i due siti lox?)
P-> GFP-> ZEO P> <-GFP <P
_____________________________________________________
Poi si forma il dsGFP:
GFP-> ZEO <-GFP
secondo la slide questo dsRNA andrebbe a bloccare l'enzima DICER stesso. (Ma il dsRNA non dovrebbe attivare l'apparato biochimico di DICER e successivamente degradare l'RNA?)
sapete dove posso trovare più informazioni su questo esperimento?
uhmm.. allora,
non è che sei stato molto chiaro, specie nel disegno...
domanda, ma ci sono 3 sequenze lox oppure la prima P sta per promotore? (immagino che la prima P sia un promotore, altrimenti non capisco che meccanismo possa essere)
Intanto ti posso rispondere sulla parte più semplice.
E' vero che le sequenze loxP servono per l'escissione del DNA che fiancheggiano... ma bisogna aggiungere "se l'orientamento delle sequenze LoxP sono uguali", ovvero nel caso
--->LoxP>--gene-->LoxP>--- = escissione --->LoxP>---
oppure
---<LoxP<--gene--<LoxP<--- = escissione ---<LoxP<---
se invece l'orientamento delle sequenze LoxP è opposto, come nel tuo caso, si ha l'inversione della sequenza di DNA in esso contenuto
--->LoxP>--Gene--<LoxP<--- = Inversione --->LoxP>--eneG--<LoxP<---
oppure
---<LoxP<--Gene-->LoxP>--- = Inversione ---<LoxP<--eneG-->LoxP>---
è possibile anche un'altra condizione un po' rara, ovvero la ricombinazione tra due diversi dsDNA con siti LoxP ad esempio tra due cromosomi fratelli che hanno singoli siti LoxP
es
--------->LoxP>--------
+++++++++>LoxP>++++++++
può diventare
--------->LoxP>++++++++
+++++++++>LoxP>--------
Tutto questo però non ha niente a che fare con l'RNA interference e l'enzima DICER. Posso immaginare che questo esperimento serva per trascrivere un mRNA palindromo e che quindi forma una forcina (harpin loop) che è molto simile a quegli RNA che sono usati dal sistema RNA interference... immagino che alcune caratteristiche di questo mRNA formato potrebbe interferire con la normale funzione di DICER, ovvero quella di riconoscere dsRNA e tagliarli, magari per saturazione o altro... Potrebbe essere utile per "eliminare il sistema di silenziamento di un gene target (in questo caso l'EGFP)" e quindi evitare il silenziamento.... "perché?  boh... forse come ulteriore controllo  "
Se cerchi un po' su internet troverai un sacco di roba sul sistema Cre LoxP
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Shasa
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
Inserito il - 16 settembre 2007 : 19:30:57
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| ok grazie!(come hai immaginato P stava x promotore) |
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cre-lox e siRNA
Didattica
