| Autore |
Discussione |
|
|
gio80
Nuovo Arrivato
Città: Palermo
5 Messaggi |
 Inserito il - 15 luglio 2007 : 16:46:55
|
Ciao a tutti io sono Giovanna da Palermo mi sono appena iscritta questo forum e ho una domanda per voi sapreste dirmi in cosa consiste la rt pcr e che differenza c'è fra la pcr qualitativa e quantitativa? grazie a chi mi risponderà
|
... i fiori recisi ancora... profumano
|
|
|
|
|
Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 15 luglio 2007 : 17:03:27
|
Praticamente con la PCR qualitativa riesci a vedere solo se hai amplificato il gene di tuo interesse mediante elettroforessi dei prodotti senza avere però una quantificazione diretta di quanto l'hai amplificato...Con la RT-PCR puoi avere una quantificazione diretta o indiretta (RT-PCR competitiva o non competitiva)di quanto gene ti si amplifica...Quantificazione diretta si usa il protocollo del 5'-Nuclease Assay che sfrutta una ssonda di DNA che ibrida all'interno del gene che vuoi amplificare e ha un Reporter Dye e un Quencher rispettivamente alle estremità 5' e 3'...Il Reporter ti dà fluorescenza registrabile e quantificabile, ma finché la sonda è intatta non può emettere perché schermato dal quencher...Quando la polimerasi sintetizza degrada con l'attività esonucleasica 5'->3' la sonda all'interno del gene e il reporter non è più schermato dal quencher cosicché potrà emettere la fluorescenza che potrà essere quantificata...Tutto ciò nella fase esponenziale della PCR...La RT-PCR competitiva e non competitiva sono sempre quantitative, ma sfruttano amplificazioni parallele nelle miscele di reazione e sono meno precise...Detto in poche parole... |
 
 |
 |
|
|
gio80
Nuovo Arrivato
Città: Palermo
5 Messaggi |
Inserito il - 15 luglio 2007 : 17:27:29
|
grazie per la spiegazione un'ultima cosa sapresti dirmi in cosa consiste la retrotrascrizione dell'rna a dna?
grazie |
... i fiori recisi ancora... profumano
|
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 luglio 2007 : 18:35:31
|
La Retrotrascrizione ti permette di ottenere DNA (chiamato cDNA) a partire da un filamento di RNA, si utilizza un enzima chiamato trascrittasi inversa (che è un enzima virale), questo è una "DNA-polimerasi RNA-dipendente" in grado di sinettizzare DNA a partire da un filamento di RNA. Per funzionare (come le DNA-polimerasi che si usano per la PCR) ha bisogno di un innesco: primer.
Si possono utilizzare tre tipi di primer:
- oligodT: cioè un primer che ha una sequenza di tante "T"questo si appaia alla coda di poly-A degli mRNA e permette la retrotrascrizione degli mRNA (non vengono retrotrascritti gli altri RNA come ad. es rRNA, tRNA...)
- random primers o (random hexamers) sono primers corti che si legano in vari punti dell'RNA e ti permettono di retrotrascrivere qualsiasi tipo di RNA, ma di soli ottieni frammenti non la sequenza intera.
Se ad es. vuoi colnare il cDNA di un determinato gene è meglio usare gli oligo-dT perchè ottieni tutta la sequenza codificante.
Spesso si usano anche miscele di questi due tipi di primers. infine ci sono:- i primers gene-specifici: utilizzi un primer specifico per la sequenza che vuoi retrotrascrivere (è come il primer reverse per la PCR)
P.S. riguardo alla PCR quantitativa e semi quantitativa ci sono molte discussioni in proposito, con il tasto "cerca" ne trovi molte, ad es. queste:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=2030
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=2045
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=3648
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=4126 |
|
|
|
gio80
Nuovo Arrivato
Città: Palermo
5 Messaggi |
Inserito il - 15 luglio 2007 : 18:45:59
|
grazie !!!!
|
... i fiori recisi ancora... profumano
|
|
|
|
bionene
Nuovo Arrivato
Prov.: Venezia
Città: venezia
22 Messaggi |
Inserito il - 16 luglio 2007 : 20:44:46
|
Ma l'RT-PCR non sta per Retrotranscription PCR? ossia amplificazione di estratti di RNA cellulari o tissutali retrotrascritti per valutarne l'espressione?
Io credo che quella che hai spiegato sia la Real Time PCR..o sbaglio? |
|
|
|
cge
Nuovo Arrivato
Città: Roma
105 Messaggi |
Inserito il - 16 luglio 2007 : 23:02:32
|
Ciao, effettivamente si utilizza rt - pcr sia per real time che per retrotranscription PCR. Quella che ha spiegato GFpina (mi perdonerà se rispondo io...) è la retrotranscription PCR.
mi permetto di aggiungere un piccolo dettaglio: è consigliabile (ma non indispensabile) aggiungere alla miscela di reazione un inibitore delle RNAasi, in modo che queste non agiscano sul RNA "template".
ciao |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 17 luglio 2007 : 14:47:44
|
Figurati cge, hai fatto benissimo!
io infatti stavo rispondendo alla seconda domanda di gio80:
Citazione:
Messaggio inserito da gio80
grazie per la spiegazione un'ultima cosa sapresti dirmi in cosa consiste la retrotrascrizione dell'rna a dna?
grazie
per la PCR quantitativa aveva già risposto Schuldiner86! io ho solo aggiunto dei link a precedenti discussioni riguardo all'argomento!
|
|
|
| |
Discussione |
|
rt pcr
Didattica
