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marcello81
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1 Messaggi

Inserito il - 18 luglio 2007 : 18:19:33

Ciao a tutti. Allora, ho un dubbio che non riesco a risolvere. Allora, ho isolato gli acidi nucleici e tolto il DNA. A questo punto ho fatto retrotrascrizione ed ho ottenuto un pool di cDNA. Per verificare la bont� di questi cDNA ho fatto PCR con primer dell'actina.
Domanda: chi mi spiega meglio il perch� di questi passaggio? In che cosa consiste "verificare la bont�"? Io penso che sia il verificare che l'RNA da cui ho ottenuto il cDNA non sia stato degradato dalle RNAsi e che il cDNA stesso, a singolo filamento, non abbia subito la stessa sorte. E' corretto? Come interpreto il gel di elettroforesi per capire che tutto sia corretto?

valia
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1001 Messaggi

Inserito il - 18 luglio 2007 : 19:35:05

Bhe, puoi controllare la bont� del tuo RNA con un gel denaturante o meno, o allo spettrofotometro.
Ma per essere sicuro che la retrotrascrizione sia andata a buon fine (potresti esserti dimenticato qualche reagente o aver usato il programma sbagliato o millioni di altri motivi) in questo caso fai una PCR in cui amplifichi un gene il cui mRNA era di sicuro presente nel tuo mix di partenza: l'actina!
Se la PCR funzia (e se quindi vedi la banda dell'actina nel tuo gel, dopo la PCR di controllo), bhe allora il tuo cDNA � OK!