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pipola
Nuovo Arrivato
Prov.: Pordenone
Città: Casarsa
14 Messaggi |
 Inserito il - 02 agosto 2007 : 11:18:21
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Ciao a tutti!
Sto cercando un'informazione su una tecnica e mi hanno suggerito di rivolgermi a voi...
Dunque, in laboratorio sto applicando una variante alla classica real time PCR ovvero: dopo 10 cicli blocco la reazione, aggiungo ulteriore mix (con una quantità dimezzata di oligo) ad ogni campione e faccio ripartire la real time PCR per altri 40 cicli. Questa tecnica del "rinfresco" mi è stata suggerita da una ragazza che lavora in lab qui con me, si ricordava di averla letta da qualche parte.
Avete per caso usato anche voi questa tecnica, o ne avete sentito parlare?...Pare funzioni, ma vorrei avere il supporto magari di qualche articolo!
Vi ringrazio in anticipo per la collaborazione!
Buon lavoro,
Elisa
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milla
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2007 : 17:42:12
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Ciao, io ho lavorato un sacco con la PCR ormai purtroppo ho dovuto lasciare la biomol!!
sinceramente non ho mai sentito parlare di questa tecnica puo'darsi che sia recente.Ma la cosa che non ho capito come mai fai fare tutti quei cicli alla PCR ( 10+40=50??). Ma forse ho capito male!
milla |
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pipola
Nuovo Arrivato
Prov.: Pordenone
Città: Casarsa
14 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2007 : 19:34:53
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Ciao Milla!
si si hai capito perfettamente!
Faccio "tutti" quei cicli (10 cicli, rinfresco con nuova mix, poi altri 40 cicli)perchè il gene che sto studiando è espresso veramente molto poco! Con una classica real time (40cicli) il segnale compariva a Ct troppo elevati (mediamente intorno al 30° ciclo, se non indeterminato), al limite della sensibilità della tecnica e cadevano fuori dalla retta standard. Quindi ho provato con 10 cicli, poi blocco la reazione quando è ancora in fase lineare (mantenedo così i rapporti), aggiungo nuova Mix (solo la q.tà di primers è metà per evitare che un eccesso aumenti la probabilità di dimeri) così che i substrati non siano in difetto. Faccio poi partire una classica real time quantitativa. Così facendo il segnale che prima compariva a 28, ora è rilevabile a 18 e tutti i campioni rientrano nella retta standard. Le differenze tra i singoli pazienti, seppur minime ora si possono apprezzare!
Spero di esser stata un pochino più chiara... o forse no...
Cmq grazie a te per avermi risposto!
Buon lavoro :) Elisa |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 03 agosto 2007 : 08:34:12
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Sinceramente non ne ho mai sentito parlare e personalmente non è che mi piaccia l'idea di aprire i tubini o la piastra durante la reazione per nessun motivo foss'anche molto plausibile, sia perchè noi abbiamo la real in "zona pulita" sia perchè puoi combinare macelli nell'aprire e chiudere i tubi.
Noi abbiamo risolto il problema dei geni poco espressi usando come standard una diluizione scalare dello stesso amplificato: viene quantizzato e quindi diluito opportunamente da 500.000 copie, fino ad arrivare a 5 copie del gene.
Dal punto di vista tecnico è fattibilissimo, basta solo un po' d'accortezza in più: in zona pulita si dispensa la mix, le acque ed i campioni, si chiudono i tubi (l'unico incoveniente è che bisogna usare tubi per via dei tappi e non la piastra), quindi si va in zona sporca e naturalmente con pipette dedicate, si dispensa la standard. Io metto anche dei bianchi in questa fase e mi vengono sempre negativi, il che ti dice che non hai combinato casini.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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pipola
Nuovo Arrivato
Prov.: Pordenone
Città: Casarsa
14 Messaggi |
Inserito il - 03 agosto 2007 : 10:21:14
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Grazie mille a Cin e a Chick80 per i preziosi suggerimenti!!!
Siete stati utilissimi! Ancora grazie!
Buon lavoro,
Elisa
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real time PCR
Didattica
