Quanto è utile/interessante questa discussione:
| Autore |
Discussione |
|
|
ElisaB.
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
6 Messaggi |
 Inserito il - 13 agosto 2007 : 16:11:37
|
Ciao a tutti!
Ringrazio veramente tanto anticipatamente chiunque avrà la gentilezza di risolvere i miei dubbi... Come vedete il post è lungo, sono prolissa nel porre le domande, ma vi prego di non spaventarvi perchè sono sicura che per chi conosce BLAST un pò meglio di me le risposte ai miei banali quesiti saranno velocissime!
Sono intenta da qualche tempo nel disegno di primers e probe MGB con Primer Express. I miei dubbi riguardano la verifica della specificità delle sequenze disegnate mediante BLAST. Quello che io faccio normalmente a questo scopo è interrogare BLAST inserendo contemporaneamente "sequenza primer F + sequenza primer R + sequenza Probe" separate da uno spazio... mi chiedo se questa è la strategia corretta, vale a dire ha senso testare contemporaneamente primers e sonda in questo modo? Il dubbio mi viene perchè osservo che spesso BLAST trova come atteso i primers entro la sequenza target ma non la sonda, eppure la sequenza elencata tra i risultati è quella giusta, cioè proprio quella usata in Primer Express per il disegno! Come mai? Questo succede anche se ripeto la ricerca modificando il parametro Expect threshold (aumentando il valore fino a 100!). BLAST riesce spesso però a trovare anche la sonda se inserisco la sua sequenza tra quelle dei due primers, vale a dire se inserisco "sequenza primer F + sequenza Probe + sequenza primer". Che significato ha questo? Perchè i risultati della ricerca dipendono così tanto dall'ordine con cui inserisco le sequenze? Evidentemente non ho capito qualcosa di importante su BLAST...
Scusate la mia ingenuità e grazie mille per l'aiuto che vorrete darmi! 
|
|
|
|
|
gioem
Nuovo Arrivato
Città: Roma
3 Messaggi |
Inserito il - 24 agosto 2007 : 15:56:22
|
ciao ElisaB.
spero di aver capito quello che hai detto. scusa se sono un po' tarda , ma ho bisogno di esempi pratici:
se non mi sbaglio tu dici che hai il primer F(es: xxxxxx) il probe (es: yyyyyyyy) e il primer R (es: zzzzzzz). mi stai dicendo che normalmente metti "sequenza primer F + sequenza primer R + sequenza Probe" quidi una sequenza formata : xxxxxxzzzzzzzyyyyyyyy. e il probe non ti viene riconosciuto.
poi invece gli metti: "sequenza primer F + sequenza Probe + sequenza prime" cioè: xxxxxxyyyyyyyyzzzzzzz e questa volta ti riconosce tutto.
giusto?
se è così quello che hai trovato non è strano, al controrio. infatti se non ricordo male blast ricerca la sequenza che tu gli metti in ordine un pezzetto per volta sulle sequenze del database. mi spiego meglio se nel database c'è una sequenza (quella dalla quale hai preso i primer)così fatta aaaxxxxxxxvvvvyyyyyybbbbzzzzz il programma allinea xxxxx con il tuo primer F poi se dopo hai messo il primer R lui lo allinea con le regione zzzzz e cerca un allineamento corretto per il probe solo nella regione successiva a zzzzz quindi non la trova. in pratica il programma non torna a cercare le seq nella sezione tra le due regioni xxxx e zzzz ma solo dopo zzzzz, dove ovviamente non c'è.
se invece inverti l'ordine e questo corrisponde a quello della sequenza allora lo trovi.
non so se già lo usi(penso di si da quello che dici) ma esiste la possibilità di allineare due seq direttamente (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi). con questo tool puoi mettere tu entrambe le seq da allineare,se posso darti un consiglio nel caso tu non sia sicura della posizione delle tue regioni usa questo tool e metti le seq primer f, primer r e probe separatamente non tutte insieme. poi quando sei sicura dell'ordine puoi anche metterle tutte (nell'ordine giusto si intende) cioè lo stesso che incontreresti seguendo la seq di origine.
spero di non aver fatto troppa confusione.
G. |
 |
|
|
ElisaB.
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
6 Messaggi |
Inserito il - 27 agosto 2007 : 09:28:17
|
Ciao gioem!
Innanzitutto ti ringrazio molto per il tempo che mi hai dedicato. Hai capito benissimo cosa intendevo dire. Alla fine anch'io sono arrivata alla tua stessa conclusione riguardo a come lavora BLAST... inserite nell'ordine corretto le sequenze vengono tutte trovate...
Ad ogni modo per verificare la specificità ho deciso di adottare la strategia di ricercare l'intero amplicone con BLAST. Quando tra i risultati della ricerca trovo che c'è una omologia di un certo peso con sequenze correlate alla mia, vado a vedere nel dettaglio se le identità tra le basi cadono in posizioni che possono compromettere la specificità dei miei primers e soprattutto delle mie sonde... spero di far bene così, che dici?
Grazie ancora, ciao! |
|
|
|
gioem
Nuovo Arrivato
Città: Roma
3 Messaggi |
Inserito il - 28 agosto 2007 : 13:38:50
|
Anche se queste cose non le faccio più da un po' di tempo , penso che la tua strategia sia corretta. in questo modo tu stai controllando la specificità dei tuoi primer su tutte le sequenze presenti in banca dati.
ovviamente se incontri delle sequenze che non corrispondono perfettamente, la tua specificità diminuirà proporzionalemnte al numero di basi non corrispondenti.
in questo modo puoi essere sicura che i tuoi primer riconoscano solo il tuo gene di interesse.
però è un po' lungo in quanto la cosa che ti interessa è solo sapere se i primer e la sonda sono specifici.
io penso che lo stesso risultato lo puoi ottenere mettendo solo primer e sonda (nell'ordine giusto si intende) e prendere solo i risultati con 100% di identità.
in questo modo sei sicura di trovarli tutti e in fretta.
buon lavoro
G. |
|
|
| |
Discussione |
|
|
|
Quanto è utile/interessante questa discussione:
| MolecularLab.it |
© 2003-18 MolecularLab.it |
|
|
|
Primer Express e BLAST... AIUTO!
Guide tools online
