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kiki
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
 Inserito il - 23 agosto 2007 : 12:00:42
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Ciao a tutti!
qualcuno di voi ha mai usato o sa come funziona il rotor gene?
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kiki
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 23 agosto 2007 : 18:14:37
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scusate per questa nuova incursione ..quello che so io sul rotor è che viene fatta una pcr usando l'eva green e mediante un software si riesce a seguire la curva di amplificazione. Secondo voi questa è una real time pcr?la fluorescenza che io vedo è dovuta al fatto che man mano che amplifica, viene incorporato l'eva green che eccitato da fonte di luce emette fluorescenza?è giusta questa interpretazione?
Con questo strumento poi è possibile fare una high resolution melt con la quale si riescono ad analizzare SNP..solo che non ho ben capito come funziona..qualcuno mi può aiutare?
Grazie ancora! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 24 agosto 2007 : 14:23:47
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Allora vediamo cosa mi ricordo del rotor gene… sono andata ad una presentazione dello strumento tempo fa ma…purtroppo le vacanze hanno un effetto deleterio sulla mia memoria!  
E’ uno strumento per fare PCR Real-Time della Corbett (venduto da Invitrogen), la sua particolarità è che al posto di avere un blocco come i classici thermal cycler ha un rotore tipo quello delle centrifughe.
- Le provette girano e vengono lette una alla volta (per spiegare meglio è un po' quello che avviene in uno spettrofotometro), il vantaggio è che il fascio di eccitazione che colpisce le provette è esattamente lo stesso per tutte e quindi non “dovrebbero” esserci differenze di eccitazione tra i vari campioni.
- Funzionando come il rotore di una centrifuga mantiene sempre il campione sul fondo della provetta evitando la formazione di bolle.
- Inoltre anche la temperatura è uniforme perché, anziché essere determinata dal blocco (che può causare differenze di temperatura nelle varie posizioni), il rotore si trova all’interno di una cameretta in cui la temperatura è determinata dal riscaldamento dell’aria (flussi di aria calda e fredda entrano nella cameretta) e questo consente che tutte le provette siano alla stessa temperatura.
- Per quanto riguarda l’High resolution melt… non ricordo tantissimo, ricordo solo che è molto più è precisa della curva di melting tradizionale in quanto ti consente di evidenziare differenze anche di un singolo nucleotide (SNP).
- EvaGreen è semplicemente un intercalante del DNA come il SYBR Green può essere utilizzato in concentrazioni maggiori è quindi sempre saturante e dà risultati più precisi rispetto al SYBR Green. Viene quindi utilizzato questo colorante per fare l'High resolution melt
svantaggio... a mio parere: devi preparare le provette singolarmente anzichè usare le piastre... e se ne hai 96 (anzi mi sembra che il limite in quel caso sia 100!) è un bel lavoro!!!
Se ritrovo i miei appunti e c'è qualcos'altro te lo scrivo, comunque qui trovi tutte le informazioni compresi un video e una presentazione che puoi scaricare:
Rotor-Gene 6000
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 24 agosto 2007 : 21:42:45
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Citazione:
Le provette girano e vengono lette una alla volta (per spiegare meglio è un po' quello che avviene in uno spettrofotometro), il vantaggio è che il fascio di eccitazione che colpisce le provette è esattamente lo stesso per tutte e quindi non “dovrebbero” esserci differenze di eccitazione tra i vari campioni.
Mi spieghi meglio questo punto?
Un lettore di piastre legge tutto in un colpo, quindi dovrebbe essere più preciso perchè "accende la luce" una volta sola... o no? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 agosto 2007 : 15:59:45
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Mi spieghi meglio questo punto?
Un lettore di piastre legge tutto in un colpo, quindi dovrebbe essere più preciso perchè "accende la luce" una volta sola... o no?
Premessa personale:
A parte il fatto che si sa, ognuno tira l’acqua al suo mulino, quindi la Corbett ti dimostra che il loro sistema con il rotore è migliore ma un'altra ditta con uno strumento classico con il blocco ti dimostrerà che è meglio il blocco… (per questo ho messo volutamente le virgolette a "dovrebbero")
Loro giustificano questo dicendo che siccome il cammino ottico è lo stesso per tutte le provette:
- non c’è bisogno di calibrazione come negli strumenti con il blocco
Infatti negli strumenti con il blocco ogni tot devi fare una calibrazione utilizzando un fluoroforo che normalizzi tutti i pozzetti in modo che non ci sia differenza di lettura tra uno e l’altro.
- non c’è bisogno di reference dyes come ROX
(in realtà non sempre si utilizza ROX)
Queste sono le motivazioni principali alle quali aggiungono che essendo il cammino ottico molto breve la "detection" è più sensibile e che il sistema è molto più semplice e richiede meno manutenzione (di questo non entro nel merito perché sinceramente non saprei!)
Comunque qua trovi la loro spiegazione più dettagliata!
Una delle critiche che si possono fare è appunto che se hai un blocco la "lettura dei campioni" (più che "l’accensione della luce" direi) viene fatta contemporaneamente mentre col rotore viene fatta una alla volte e benché sia molto veloce ci possono essere delle variazioni dovute al "tempo" in cui viene letto il campione.
La luce nel caso del Rotor Gene è un led (o più leds) che mi sembra che rimanga sempre acceso durante la lettura di tutti i campioni non acceso e spento tra uno e l’altro. A quanto mi ricordo che avevano detto al corso il vantaggio di avere dei leds è che durano molto di più rispetto ai sistemi utilizzati per le real time classiche... ma i miei ricordi si affievoliscono e di cose tecniche non ne capisco molto!
Un’ultima considerazione che mi è venuta in mente:
ti dicono anche che leggendo la provetta da sotto anziché da sopra puoi scrivere sui tappini... eh eh eh... meno male altrimenti con 100 provette senza scriverci niente pensa che confusione rischi di fare!!!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
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Rotor
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