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flavio74
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 01 settembre 2007 : 14:00:16
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 Ragazzi una informazione: se io sto in un laboratorio, con gli strumenti di base, e ho bisogno di prelevare un gene specifico, ad esempio quello per l'insulina o di un'altro prodotto noto cosa devo fare; del gene ovviamente voglio poter prendere sia il promotore che il cDna... grazie
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2007 : 18:35:11
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Scusa ma non ho capito molto bene la domanda... in che senso "prelevare" un gene? A cosa ti serve poi?
Per ora posso dirti che puoi utilizzare la PCR: amplifichi da DNA il promotore mentre da RNA ottieni il cDNA e puoi amplificarlo sempre mediante PCR.
Poi se ti interessa clonarlo ad es. per far esprimere la proteina devi legare promotore e cDNA e metterli in un vettore... ma dipende anche molto da cosa ci devi fare. |
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flavio74
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2007 : 19:20:36
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mi serve sia per produrre la proteina del gene sia per fare studi sul promotore, ma vorrei evitare di farmi sintetizzzare la sequenza ad oc; vi faccio un esempio (sempre quello dell'insulina): ho un campione di cellule di tessuto sano; da queste mi estraggo il dna; dopodichè voglio isolare la sequenza codificante e relativo promotore per l'insulina; cosa devo fare materialmente;
grazie a tutti     |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 16 settembre 2007 : 17:21:28
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Caro Flavio74,
questo è un lavoraccio bello pesante per uno inesperto.
per quanto riguarda il cDNA codificante è facile, basta che estrai l'RNA da un tessuto che esprime quel gene, nel tuo caso cellule beta del pancreas. Tecnicamente espianti il pancreas e prendi gli isolotti pancreatici, ci metti su il trizol 1 ml per ogni 8 gr di tessuto, omogenizzi, poi segui il protocollo fino ad ottenere l'RNA in acqua. Retrotrascrivi in cDNA con la Superscript II, poi amplifichi per PCR tramite primers specifici per quel gene e ottieni il cDNA dell'insulina.
Per fare questo però è necessario che...
1) l'RNA estratto non sia troppo degradato
2) devi usare gli esoesameri al posto degli oligodT se il gene non presenta la sequenza di poliA
3) il cDNA non deve essere troppo lungo altrimenti devi usare delle Taq particolari come l'Expand oppure la Clontech
4) ci vuole anche un po' di fortuna a scegliere i primers e le condizioni sperimentali ideali
Per quanto riguarda il promotore la cosa si complica molto.
Dato che il promotore raramente è trascritto in RNA devi necessariamente amplificarlo dal DNA genomico, estratto in modo simile all'RNA.
per utilizzarlo e clonarlo è necessario che...
1) il promotore in questione sia già noto nei minimi dettagli dalla letteratura altrimenti non sai cosa prendere nel DNA genomico
2) il promotore non sia troppo lungo, altrimenti non riesci ad amplificarlo per PCR, avresti troppi errori durante l'amplificazione, potrebbe essere difficile clonarlo e gestirlo, per non parlare di trasfettarlo in cellule
3) poi ci sono i classici problemi nell'amplificazione del DNA genomico che deve essere più o meno integro e dovresti lavorare un po' per trovare le condizioni ideali.
4) La zona non deve essere ricca in Citosine e Guanine, altrimenti sono dolori a trovare le condizioni buone per la PCR, idem se ci sono troppe A e T
5) funzioni o che sia già stato testato nel modello che intendi usare, ovvero per es nel tuo caso il promotore dell'insulina funziona solo nelle ceulle beta del pancreas, sarebbe strano che funzioni in una cellula diversa, e se troveresti una cellula diversa che esprime già l'insulina potrebbe essere inutile tutta la procedura 
6) in ogni caso tutto quello che scopriresti del promotore non è detto che sia valido anche quando questa sequenza sia presente nel genoma... tantissimi eventi epigenetici, cromatinici etc sono difficili da riprodurre in una sequenza presa e messa in un vettore. Tanto è vero che tanti promotori tessuto specifici possono diventare aspecifici in vitro (magari perché incompleti nella sequenza o nella regolazione).
Insomma ci vuole un bel po' di esperienza ed una buona guida per fare questo...
...ma in genere in questi casi si cerca tramite le amicizie di chiedere il vettore completo e pronto a qualcuno che lo ha già fatto in letteratura, magari in cambio di ringraziamenti o collaborazione nel lavoro. Risparmi un sacco di soldi e tempo, e sei sicuro che il materiale sia accettato dalla letteratura.
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estrarre un gene da clonare
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