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kiki
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 Inserito il - 13 settembre 2007 : 20:52:41
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Ciao a tutti! Non riesco a capire una cosa: ricostruendo l'aplotipo si riesce a capire se dei loci sono in linkage disequilibrium?
Mi spiego meglio:
In laboratorio sto facendo analisi di SNP in un gene e nel suo recettore. In un recente articolo è riportato che questi SNP sono risultati in linkage disequilibrium completo.
Noi abbiam analizzato 4 polimorfismi del recettore (A>T; T>A;C>G e
A>T) e abbiam trovato che quasi tutti gli individui sono omozigoti ATCA, in caso invece presentino il polimormorfismo sono TAGT.
Alcuni individui invece presentano un genotipo diverso per esempio sono OmoA(al primo locus), Het(T/A) al secondo locus OmoC al terzo e OmoA al quarto locus; oppure OmoA,Het,Het,OmoA
Io vedendo che in genere sono quasi tutti ATCA oppure TAGT o in caso siano Het ad un locus risultano Het anke agli altri 2 posso pensare che i 4 loci siano trasmessi in blocco e quindi siano in linkage disequilibrium?come faccio a saperlo con certezza?E per gli individui che non presentano questo andamento? significa che non sono in linkage disequilibrium?
2.Nell'articolo continuano dicendo che per calcolare il linkage disequilibrium hanno usato il programma PHASE e Haploview..
Il programma PHASE in pratica permette di ricostruire l'aplotipo: ma se conosco già il genotipo a che mi serve ricostruire l'aplotipo?
Aplotipo e genotipo in sostanza non sono la stessa cosa?
Mi serve per capire come sono gli eterozigoti? tipo se ho OmoA Het(T/A) Omo A, mi serve per capire se è T/A o A/T? ovvero per capire quale è trasmesso dal padre edalla madre?Ricostruire la fase a che mi serve?
Il programma PHASE alla fine mi dà degli output tipo:frequenza aplotipi, e frequenza di ricombinazione tra un locus e l'altro: questa frequenza di ricombinazione nn potrebbe servirmi per capire se sono in linkage disequilibrium? in genere se 2 loci sn in likage disequilibrium la frequenza di ricombinazione tra un locus e l'altro è molto bassa giusto?
Poi ho letto ke con il programma haploview si riesce a calcolare il coefficiente di linkage disequilibrium (D). Qualcuno ha idea di come funziona questo programma?ho letto leistruzioni ma nn ho capito molto, anke perchè gli unici esempi che fanno è con i marcatori microsatelliti e bisogna inserire dati che riguardano la famiglia..ma io non li ho, ho solo il genotipo di questi individui (SNP)e non
riesco a capire come creare il file di input..
Scusate tanto questa lunga discussione..ma è un po' che ho questi dubbi e sto cercando di uscirne fuori in qualche modo perchè devo scrivere i risultati della tesi inserendo questi dati..
Grazie infinite per il vostro aiuto!!!
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cge
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Inserito il - 14 settembre 2007 : 10:52:21
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ti do due rapide informazioni, se ho tempo dopo ti rispondo in modo più estensivo.
Ricostruendo l'aplotipo non puoi sapere se i loci sono in linkage disequilibrium. per l'aplotipo devi fare una stima con l'algoritmo EM, in quanto se ci sono eterozigoti non conosci la fase gametica (lo puoi fare ad esempio con Arlequin 3.0 o con phase.).
Aplotipo e genotipo non sono la stessa cosa. il genotipo si riferisce a un sito polimorfico , mentre l'aplotipo è la combinazione allelica di più siti polimorfici.
Due loci sono in linkage quando la frequenza attesa dell'aplotipo (prodotto dell frequenze degli alleli di cui è composto l'aplotipo) è significativamente diversa, quindi "molto" pià alta o bassa della frequenza osservata dell'aplotipo.
ciao
S. |
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kiki
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Inserito il - 14 settembre 2007 : 14:44:25
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Grazie!ma quando dici che se ci sono eterozigoti la fase gametica non è nota, cosa significa?potresti fare gentilmente un esempio?(perdona l'ignoranza ma ho un po' di confusione in testa su questo argomento)
Tipo se ho un A T C A eterozigote per un locus oppure per tutti e
A T G A
quattro tipo A T C A non so se è così come è scritto oppure T A G T ?
T A G T A T C A
Ricostruire l'aplotipo degli eterozigoti che utilità ha?
Per quanto riguarda l'output che mi dà phase sulla ricombinazione tra un locus e l'altro come va interpretato?
E Haaplview hai per caso idea di come si fa a creare il file di input?(dalle istruzioni nn ho capito molto anke xkè rchiedono di inserire informaz che io nn ho :tipo padre, madre, marcatori)
Grazie infinite!!e scusa l'insistenza nel richiedere le stesse cose..ma è da un po' che mi sto scervellando su queste cose..ma ho un gran casino in testa  e la data di laurea si avvicina
Grazie!
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cge
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Inserito il - 14 settembre 2007 : 16:09:39
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Per il fatto che tu non sai dove sono posizionati i diversi alleli nei cromosomi omologhi. ad esempio, se consideriamo due siti polimorfici e questi sono eterozigoti A/T e C/G, gli aplotipi possibili sono:
AC
TG
AG
TC
però realmente l'individuo ne porta solo due (perchè i cromosomi omologhi sono 2). infatti non puoi sapere se in un cromosoma c'è A C o A G.....l'algoritmo EM fa una stima di quelli più probabili.
sinceramente ho usato solo una volta PHASE, per prova, e non ho mai usato aploview. In genere uso Arlequin, che lo stesso elabora i dati con l'algoritmo E.M., ed è un programma utilizzato quanto phase per la stima delle frequenze aplotipiche.
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kiki
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Inserito il - 15 settembre 2007 : 10:16:34
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ah quindi se ho capito bene non so come sono disposti nei due omologhi, per esempio se ho 4 siti polimorfici come nel mio caso A>G, T>A, C>T e A>G e un ndividuo risulta eterozigote x questi 4 siti vuol dire che potrebbe avere:
un allele ATCA e l'altro GATG oppure
un allele AATG e l'altro GTCA oppure
" "ATCG e l'altro GATA
e così via ?
A cosa serve a me ai fini analisi genetica sapere come sono sistemate le basi nei due omologhi?a che mi serve conoscere la fase?
Nel programma PHASE mi richiede di inserire i oltre al numero di indivicui, num di loci, posizione loci, anche il genotipo di ogni individuo.
Per cui io go inserito come era suggerito, per esempio individuo uno omozigote:
#1
ATCA
ATCA
individuo 2 eterozigote x tutti e 4 i siti:
#2
ATCA
GATG
da quello che hai scritto xrò questo è solo uno dei possibili eterozigoti,in teoria il programma dovrebbe darmi una frequenza delle altre combinazioni,oppure nel caso sia eterozigote secondo te devo inserire io le varie combinazioni?
L'altro programma che mi hai citato (Arlequin)come funziona per quanto riguarda gli eterozigoti?bisogna inserire anke lì il genotipo x ogni individuo?
Ancora grazie mille!!! |
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cge
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Inserito il - 15 settembre 2007 : 13:09:25
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esatto!
conoscere la fase, e quindi gli aplotipi ti da un livello di informatività maggiore, ad esempio, se un uno studio di associazione vuoi valutare qualche fattore genetico di rischio. trovi che un aplotipo ha una frequenza molto alta nel campione dei patologici rispetto ai sani, quindi da li puoi trarre varie conclusioni, considerando anche l'effetto fenotipico che ha il dato aplotipo. senza poi contare l'utilità nell'antropologia molecolare, nel quale gli aplotipi hanno un livello di informatività molto più alto dei singoli genotipi o della somma dei genotipi per caratterizzare geneticamente una popolazione e la sua storia demografica.
per quanto riguarda l'inserimento dei dati, tu inserisci i genotipi (lo stesso vale con arlequin, usano lo stesso algoritmo) e il programma ti calcola quale è la combinazine aplotipica più probabile. ricorda che si tratta di una stima, non è una conta degli aplotipi, e ti viene fornita una deviazione standard.
Ciao |
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kiki
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Inserito il - 15 settembre 2007 : 14:12:59
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Grazie davvero!sono contenta di essere riuscita a capire!
Stamattina mi sono scaricata Arlequin. Avrei bisogno di un'ultima informazione, ho visto leggendo le istruzioni che si può scegliere se inserire come dato gli aplotipi o i genotipi, cliccando su una casellina..ma cosa cambia?
E l'ultimissima cosa: quando te inserisci il genotipo dell'eterozigote per più siti polimorfici gli dai una sola possibile combinazione?In questo modo mi sa che lui te la dà con una probabilità di 1 almeno in PHASE ho notato che se io gli inserisco x esempio ATCA/GATG lui mi da questo aplotipo come se fosse certo,con una probabilità uguale a quella dell'omozigote x tutti i siti polimorfici; se invece metto uno dei siti come sconosciuto per esempio
?TCA/?GATG PHASE mi da come possibili aplotipi:
ATCA , AATG , 0.316
AATG , GTCA , 0.013
ATCA , GATG , 0.670
queste xrò non sono tutte le possibili combinazioni..xkè?forse xkè mi da solo quelle più probabibili?
La cosa importante che non riesco a capire è che genotipo devo inserire x l'eterozigote, perchè se glielo scrivo tutto completo in pratica è come se conoscessi già la fase,mentre se metto un ? in qualche posizione lui mi da i vari aplotipi possibili..in genere in questi casi come si deve inserire il genotipo dell'eterozigote?
Scusa se sono stata un pochino ripetitiva..ma se sbaglio ad inserire i dati poi i risultati che ottengo non hanno molto "valore"..
Grazie davvero tanto! |
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cge
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Inserito il - 15 settembre 2007 : 19:29:40
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beh, gli aplotipi li inserisci dopo che te li sei calcolati per fare altre valutazioni, come i test di neutralità, Rst, Fst. nel tuo caso se ti devi calcolare le frequenze aplotipiche dovrai inserire i genotipi.
per preparare il file di dati, e per non incorrere in errori, utilizzo questo sistema: io mi preparo il file di genotipi su excel, poi lo copio su genetix (http://www.genetix.univ-montp2.fr/genetix/genetix.htm), e da li faccio la conversione per arlequin....
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kiki
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Inserito il - 19 settembre 2007 : 18:46:56
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Grazie mille x tutte le info!Cavoli ora devo scrivere un paragrafo nella tesi in cui descrivo brevemente i programmi PHASE e Haploview..Help..non so davvero da che parte iniziare..xkè le istruzioni in cui è riportato il principio son molto complicate..
Avrei bisogno ancora una volta di un aiutino a capire una cosa:
nel manuale di PHASE riportano questo:
dicono che PHASE versione 2.0 si differenzia dall'1.0 per questo:
" the introduction of a new model that allows for ricombination and decay of Linkage disequilibrium with distance, which results in more accurate haplotype estimates"
questo cosa sisgnifica?che permette di ottenere migliori risultati perchè calcola la ricombinazione tra un locus e l'altro e la diminuzione del linkage disequilibrium con la distanza?
xrò nn mi pare ke questo programma calcoli il linkage diseq.
Tra gli output xrò questo programma dà un file che spiegano così:
"recom_ Contains estimates of recombination parameters across the re-
gion, using the general model for varying recombination rate
from Li and Stephens (2003). (Note: these estimates are pro-
duced only if the recombination model is used: see the -M option.
Also, the estimates have a straightforward interpretion only if
the positions of the loci are speci ed in the input le.) The
rst line of the le gives the positions of the loci in the input
le (to facilitate subsequent analyses using results in this le).
Each subsequent line of the le gives a sample from the pos-
terior distribution of the recombination parameters. The rst
column gives estimates of the background recombination rate
(more precisely, the value of the population genetics parameter
ˆ, here denoted ˆ). Column 2 gives the factor by which the re-
combination rate between locus 1 and 2 exceeds the background rate, and, similarly, column i gives the factor by which the rate
between locus i exceeds the background rate.
To get point estimates of these quantities I suggest taking the
median of the results for each column. If you are planning to
make use of the results from this le, then it is advisable to use
the -X option described later (eg -X10 or -X100), to obtain more
accurate estimates."
In pratica tra i risultati questo programma mi da un file in cui in ogni riga son riportate lr ricombinazioni tra un locus e l'altro..ma c'è un parametro x valutare se i valori di ricombinaz che lui mi dà è alto o basso?c'è un range?
E che senso ha che mi dia un sacco di righe con le ricombinazioni?
In allegato metto il file con riportati in prima rga le posizioni dei loci e sotto tutte le frequenze di ricombinazione..secondo voi come vanno interpretati?
Allegato:  ricombinaz.doc
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