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atreliu
Amministratore

Prov.: Milano
Citt�: Milano

2484 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2003 : 15:30:18

Il vettore pET � in un sistema che prevede due parti: nel genoma ed il vettore..
Nel genoma:
� presente il promotore Lac seguito dalla polimerasi T7.

Il vettore:

Questo vettore contiene un marker (verde), il gene LacI (blu), il promotore di trascrizione T7, l'operatore Lac (verde petrolio) in 3' al promotore T7, e un polylinker (nero), in cui verr� inserito il frammento/gene da amplificare.

Si � scelto una polimerasi fagica per due motivi:
-l'attivit� del promotore T7 sul vettore, dipende dall'espressione sul genoma della polimerasi fagica T7 (e quindi dalla sua espressione regolata da Lac).
-la forte processivit�, e quindi espressione del gene da amplificare.

Controllo regolazione:
L'inserimento di IPTG o un altro analogo del lattosio prevede che questo si leghi al repressore presente a livello del promotore Lac, permettendo quindi la trascrizione ed espressione della polimerasi T7.
Una volta prodotta la polimerasi, questa va subito a permettere l'espressione del gene inserito sul vettore.

Si pensi che in poche ore, il componente principale della cellula risulta essere il prodotto del gene inserito.
In realt� una velocit� cos� alta pu� causare problemi di folding nelle proteine complesse. Per ovviare a questo problema si possono attuare condizioni diverse (diminuizione temperatura di crescita, etc), o cercare un sistema di regolazione/inibizione di Lac, o puntare verso un sistema di espressione pi� tradizionale (scelta di un promotore meno processivo).

Sperando che possa essere utile..

Riky