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biomol
Nuovo Arrivato
65 Messaggi |
 Inserito il - 21 settembre 2007 : 12:05:45
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ciao, ho bisogno di un parere.ho fatto 2 western blot su proteine diverse, con anticorpi diversi e mi è capitata per due volte la stessa cosa, cioè il segnale è debole e dopo la prima esposizione che dura al max 5 minuti le altre praticamente non mi danno segnale. escludendo i liquidi di sviluppo che funzionano e gli anticorpi cosa potrebbe essere?leggendo il data sheet del liquido di rivelazione mi dice che se il segnale dura meno di 8 ore è perchè l'Ab secondario è troppo diluito, il che mi lascia un pò perplessa...potrebbe essere il liquido di ECL scaduto?(ho iniziato ad usarlo un anno fa ma non sò a quando risalga)....
grazie
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2007 : 14:14:18
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potrebbe dipendere da molte cose, in primo luogo dalla tua concentrazione di proteine che potrebbe essere troppo bassa e quindi darti un segnale debolissimo. Sul data sheet del secondario qual è la diluizione suggerita? Certo potrebbe essere anche un problema di ECL (credo che la durata media sia un anno), ma quando mi è capitato di avere segnali deboli è sempre dipeso da basse concenteazioni di proteine? Quanto carichi in genere?
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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biomol
Nuovo Arrivato
65 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2007 : 20:32:18
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ciao.il problema delle proteine l'ho escluso perchè normalmente con 50 microgrammi di proteine ho sempre un buon segnale che on decade comunque con questa velocità...l'unica coa che ho pensato è che l'ecl fosse andato, ma poi sul suo data sheet ho trovato l'indicazione del secondario...non sò se vale la pena provare..tu che mi consigli?
grazie |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2007 : 21:07:24
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un secondario troppo concentrato ti potrebbe dare problemi di "sporco", in ogni caso se decidi di aumentarlo ti conviene lavare molto bene la membrana. Il fatto che tu carichi 50 microgr di proteine è ininfluente se è la prima volta che lavori con questa proteina. Voglio dire che magari la tua proteina è espressa poco e quindi nel lisato è poco rappresentata e di conseguenza il segnale è debole (non credo che tu stia lavorando con un immunoprecipitato, o no?).
alle volte a me è capitato di avere dei segnali apprezzabili dopo un'intera notte di esposizione!!!Quindi puoi provare varie cose: aumentare le proteine, aumentare il secondario (lava benissimo!), provare un altro ECL o esporre molto a lungo.
facci sapere. |
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Eleo
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Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2007 : 22:50:20
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secondo me oltre che provare a caricare una quantità maggiore di proteine e aumentare la concentrazione del secondario, se ottieni un segnale ancora troppo debole puoi provare un sistema di rilevazione più sensibile dell'ECL, per esempio Super Signal West Pico Chemioluminescent della Pierce o Super Signal West Dura Extended Duration sempre della Pierce. facci sapere. ciao
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biomol
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65 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2007 : 20:08:37
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ciao.allora io uso l'ECL Super Signal West Pico Chemioluminescent della Pierce...ho provato a fare come mi diceva il data sheet , cioè diliuire di almeno 10 volte la concentrazione del secondario, effettivamente per un anticorpo in questo modo ho riolto il problema, ma per l'altro la cosa è peggiorata, ora non ho neppure il segnale... ....mah!non so per voi ma per me il western è sempre un terno al lotto, sono più le volte che non esce che quelle che esce....ciao e grazie a tutti... |
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ChEyEnNe
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 04 ottobre 2007 : 11:54:33
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ho avuto un problema del genere tempo fa...
il problema stava sull' Ab secondario che (per ignoti motivi) non dava il risultato desiderato, malgrado abbia usato una concentrazione molto alta (1:750), continuavo a vedere questa banda pallidissima....con red ponceau vedevo la banda sulla membrana ma non la vedevo in chemiluminescenza. ho usato ECL Super Signal West femto Chemioluminescent della Pierce ed ho ottenuto il risultato desiderato ma con un bel background
altri Ab secondari non mi hanno mai dato di questi problemi, forse era solo quel boccetto di quell'azienda. ora non ho più a che fare con quell'azienda e dunque non posso stabile se fosse colpa del boccetto o dell'anticorpo in generale |
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bande western blot
Didattica e Relazioni
