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Mare Nostrum
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 26 settembre 2007 : 15:49:44
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Salve a tutti!
Il mio dubbio è il seguente: per sbaglio ho retro trascritto il mio RNA totale con un primer oligo dT, dico per sbaglio in quanto dovevo poi usare il cDNA in qRT-PCR usando come gene house keeping il 18S.
Ho ottenuto delle curve di amplificazione per il gene ribosomiale 18S molto belle, una sola dissociation curve e delle Ct value molto vicine. Come può succedere questo dal momento che ho retro trascritto solo l'mRNA?????
Sto amplificando del genomico??Se qualcuno ha una risposta ne sarei felice!!Ciao
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
280 Messaggi |
Inserito il - 28 settembre 2007 : 09:04:57
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| Non capisco bene il tuo problema... Magari se me lo riformuli mi si accende la lampadina. |
Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 28 settembre 2007 : 20:45:51
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Caro Mare Nostrum,
direi che l'errore è molto grave e non è stato molto saggio da parte tua continuare comunque a fare la Real Time su questo cDNA.
1) La prima questione semplice è se la temperatura di melting della curva di dissociazione sia proprio del tratto 18S che stai amplificando.
2) Hai trattato il tuo RNA con la DNase (RNasi-free)? Hai fatto un controllo negativo? ovvero un RNA che ha avuto tutti i trattamenti tranne la Superscript e che poi hai messo nei pozzetti della Real-Time per verificare le contaminazioni da genomico.
3) I primers che usi sono a cavallo di introni? Direi di no dato che la 18S non ha introni, quindi probabile che stai amplificando il genomico, qualche contaminazione oppure dei dimeri degli stessi primers, per cui è assolutamente necessario un controllo negativo con RNA.
4) A quali cicli compare l'amplificato dell'RNA 18S? considerando la sua abbondanza direi che debba comparire entro i primi 15 cicli... se compare in vicinanza all'amplificato del tuo gene in analisi allora saprai che stai proprio amplificando da genomico.
Valuta bene... le macchine e gli esperimenti danno sempre delle risposte... il ricercatore sta là per capire se la risposta è affidabile o no.
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Mare Nostrum
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2007 : 12:44:26
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Grazie per la tua risposta,
lo sò che l'errore è grave, ma me ne sono accorta di aver usato l'oligo dT troppo tardi..Ti dirò subito non c'avevo proprio pensato visto che la mia curva di amplificazione sale intorno al 7 ciclo e le Ct value sono molto vicine e la dissociation è unica e con una temp di melting giusta. Non credevo di aver fatto un errore così stupido ma quando si ha troppo da fare si sbaglia.
Comunque per risponderti: non ho fatto i trattamenti con DNase o RNase treatment ma ho fatto un controllo positivo, il quale era negativo.Sicuramente mi sto portando dietro del genomico!
Grazie ancora, ciao!!!
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oligo dT
Didattica
