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calcio
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
2 Messaggi |
 Inserito il - 28 aprile 2005 : 19:54:17
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Ciao a tutti sono un nuovo utente sono venuto a conoscenza del sito oggi , introduco questa discussione per 2 motivi :
1 farmi conoscere
2 cercare di ricevere da voi informazioni per un protocollo riguardante l'estrazione del dna dal c.elegans.
fraquento il terzo anno del liceo scientifico e amo la biologia ma purtroppo ieri non ero ha scuola e non ho assistito all'asperimento ,spero mi rispondiate grazie
Roberto
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2005 : 09:18:21
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Allora, qui trovi una dettagliata descrizione dell'esperimento: http://www.ksu.edu/hermanlab/protocols/genomic_dna_prep.htm
Comunque, a parte tutti i dettagli tecnici  , per estrarre il DNA da un qualsiasi tessuto devi (nota che sono step semplificati):
1) distruggere le cellule x poter quindi estrarre gli acidi nucleici che stanno all'interno: questo step lo fai anche x estrarre l'RNA o le proteine. Per lisare le cellule si può usare SDS (sodio dodecil solfato) o Triton X-100 o altre sostanze che essenzialmente sono dei detergenti e hanno la capacità di distruggere il doppio strato di fosfolipidi delle membrane.
2) Una volta che hai il contenuto intracellulare procedi in modo differente a seconda di quello che devi estrarre. Poichè il DNA è legato nella cellula a proteine devi distruggerle usando una proteasi (come la proteinasi K, ad es.) che, tra l'altro distruggerà anche le DNAsi, enzimi che distruggono il DNA. Si può aggiungere anche una soluzione tampone a pH lievemente basico x mantenere il DNA in soluzione e dell'EDTA per sottrarre alla soluzione ioni Ca++ e Mg++ che sono essenziali x il funzionamento delle DNAsi.
3)Si procede quindi alla estrazione in un mix di fenolo + cloroformio (da fare sotto cappa!) in modo che il DNA (e l'RNA) se ne vada nella fase di cloroformio e le proteine nel fenolo.
4) Si centrifuga e si butta via il fenolo (in appositi contenitori! è tossico, cancerogeno, inquinante etc. etc. etc.)
5) Si può quindi aggiungere etanolo assoluto che fa precipitare il DNA (e l'RNA) come un filamento bianco e abbastanza viscoso che può essere recuperato con una centrifugazione e successiva essiccazione sotto vuoto.
Ovviamente questi passaggi mancano di un po' di step. In genere in laboratorio (a meno di non essere a corto di soldi come succede, ahimè in molte università italiane) per estrarre il DNA o l'RNA si usano apposite colonnine e soluzioni vendute in kit già belli e pronti (ad es. dalla Qiagen) che essenzialmente fanno questi step, ma ti permettono di fare un estrazione molto + pura, senza usare fenolo e in circa 10 minuti (rispetto alle ore di lavoro x farlo a mano).
Ciao e benvenuto sul forum!
nICO |
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protocollo di estrazione del dna dal c.elegans
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