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MrX83
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
20 Messaggi |
 Inserito il - 01 ottobre 2007 : 19:15:40
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Innanzitutto scusate se ho sbagliato sezione del forum ma è la mia prima volta 
In pratica il problema è ke tra 3 giorni ho l'esame di biologia molecolare e tra le tante tecniche ce ne sono 2 su cui davvero non ho capito un tubo...e cioè run off e run on e il corrispettivo plasmide nel quale si possono effettuare ossia pGEM
Qualcuno mi può illuminare sull'arcano o indicarmi qualke sito ke può farlo? grazie
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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MrX83
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
20 Messaggi |
Inserito il - 02 ottobre 2007 : 07:46:48
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Grazie GFPina...da quel ke ne ho capito io il run-on serve x capire quali sono i geni in attiva trascrizione in un determinato momento e se non vado errato può servire anke x marcare molecole di RNA.
Il mio problema più grande però rimane sempre run-off, ed il plasmide pGEM con cui si attua tale tecnica. Mi sembra di ricordare ke il run-off serva x capire dove termina la trascrizione di un determinato tratto genico...ma sinceramente non ricordo proprio come funzioni |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 02 ottobre 2007 : 08:11:37
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| il run-off serve piu' che altro a saggiare il tasso di trascrizione in base all intensita' della banda in !vitro! e l accuratezza della trascrizione,e' anche possibile misurare la lunghezza del trascritto e quindi il sito d inizio della trascrizione,ora devo andare a Lezione piu' tardi aggingo qualcosa se non ti e' ancora chiaro |
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MrX83
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
20 Messaggi |
Inserito il - 02 ottobre 2007 : 12:07:01
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patrizio ti dico quello ke ho capito fin'ora...tu correggimi se sbaglio o aggiungi le cose ke mi sfuggono
con il run-off posso ottenere un RNA marcato con radioisotopi...è possibile effettuare il run-off tramite il plasmide pGEM che contiene 2 promotori (T7 ed SP6) per RNA polimerasi virali...una volta inserito l'inserto effettuo un taglio al fine di linearizzare la molecola e tramite la polimerasi virale e nucleotidi marcati ottengo un RNA marcato. La tecnica si chiama run-off poichè ad un certo punto lo stampo di DNA termina (causa taglio effettuato precedentemente) e quindi di conseguenza termina anche la trascrizione.
il run-on invece serve per capire quali geni di un detemrinato DNA genomico sono in attiva trascrizione in uno specifico istante...si blocca la trascrizione (forse con actinomicina) e in vitro faccio successivamente riprendere la stessa immettendo nucleotidi marcati. facendo questo con 2 cellule posso ottenere un confronto dei geni ke vengono codificati in determinate condizioni e/o in un determinato istante. La tecnica però è abbastanza obsoleta e di difficile attuazione e quindi è stata soppiantata dalla più recente tecnica che prevede l'utilizzo dei chip di microarray
giusto?  |
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Demi
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 02 ottobre 2007 : 13:45:11
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va benissimo così.in bocca al lupo per il tuo esame. |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 02 ottobre 2007 : 19:21:17
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con il run-off devi ottenere RNA marcato se no non si vede niente sulla lastra,riguardo al plasmide il pGEM per quanto mi risulta si usa per il saggio di protezione all'RNAasi(RNase protection assay),a cosa potrebbero servirti questi promotori se a te serve saggiare l attivita' di altri...quindi secondo me questo non si usa,in quanto a questa tecnica ti permette di misurare il tasso di trascrizione di un promotore X e quindi puoi vedere anche l accuratezza appunto(se a seguito di una mutazione la grandezza del trascritto e' sempre la stessa) e la quantita' di trascritto in presenza di mutazioni, oppure l effetto di elementi di regolazione a monte,una volta che hai inserito il frammento di DNA nel vettore contenenti gli elementi in esame tagli con un enzima di restrizione e ottieni il frammento(un sito di restrizione deve cadere nella sequenza codificante)e dato che si conosce la grandezza del frammento tagliato dall enzima se il frammento e' grande 300Kb e il tuo trascritto e' di 50Kb significa che l inizio della trascrizione avviene 50 nt a monte del sito di restrizione in 3'( e questo e' un dato),per la quantita' di trascritto prodotto lo vedrai sulla la lastra in base all intensita' del segnale ,piu' il segnale e' marcato piu' trascritto c'e'...ovviamente penso che questo esperimenti si facciano in parallelo con un controllo
per quanto riguarda il run-on la trascrizione di altri geni che non sono stati ancora trascritti si blocca estraendo i nuclei,in questo non arrivano piu' segnali nel nucleoplasma e i geni si stanno trascrivendo continueranno ad essere trascritti,per avere maggior certezza di questo si puo' aggiungere l eparina che e' un polisaccaride anionico che si lega alle RNA pol che non stanno trascrivendo...a questo punto poi vedere se 2 geni di tuo interesse sono stati trascritti in un dato istante e per fare questo ti ricavi i target e le vai ad ibridare con il tuo estratto di RNA sonda se quei 2 geni sono stati trascritti ibrideranno il target e osserverai il segnale e annche qui in base all intensita' puoi vedere quanto piu' o meno e' stato trascritto il gene
Ma tanto effettivamente ste cose non si usano piu'(credo) ...come hai detto ci sono gli array che li hanno superati alla grande |
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Run-off, run-on e pGEM
Didattica
