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kiki
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
 Inserito il - 05 ottobre 2007 : 14:13:36
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ciao a tutti! secondo voi che vantaggi presenta analizzare polimorfismi o mutazioni mediante curve di melting rispetto alla dhplc? Io ho usato l'high resolution melting che distingue differenze in una sequenza in base alla diversa temperatura di melting e mi han detto che questo metodo è più sensibile e più vantaggioso rispetto alla Dhplc, ma perchècon la dhplc riesco a distinguere gli omozigoti per un polimorfismo o per una mutazione?oppure riesco a vedere solo gli eterozigoti?
Che differenza presentano le taq uasate per pcr real time rispetto x esempio alla taq gold?
io ho usato la Takara ex taq, qualcuno di voi l'ha mai usata o ne ha mai sentito parlare?io so solo che è specifica per real time. Nell'analisi che ho fatto io mediante real time pcr, con la taq gold abbiam ottenuto brutti risultati mentre con la takara ex taq va molto meglio..ma che differenze ci può essere con la taq gold?
Grazie mille a tutti!!!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2007 : 20:32:05
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Rispondo alla prima domanda:
Citazione:
Messaggio inserito da kiki
... ma perchècon la dhplc riesco a distinguere gli omozigoti per un polimorfismo o per una mutazione?oppure riesco a vedere solo gli eterozigoti?
In teoria con la DHPLC riusciresti a distinguere solo tra omoduplex e eterodulex e quindi non vedresti una mutazione in omozigosi... ma c'è un trucco: mischiare il campione in esame con un controllo omozigote "senza mutazione" in modo da permettere la formazione dell'eteroduplex!
Come è spiegato in questo pdf
I vantaggi della high resolution melt panso che siano oltre ad una maggiore sensibilità, il tempo e sinceramente non so per i costi! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2007 : 00:40:02
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Per rispondere alla seconda domanda:
Citazione:
Messaggio inserito da kiki
Che differenza presentano le taq uasate per pcr real time rispetto x esempio alla taq gold?
io ho usato la Takara ex taq, qualcuno di voi l'ha mai usata o ne ha mai sentito parlare?io so solo che è specifica per real time. Nell'analisi che ho fatto io mediante real time pcr, con la taq gold abbiam ottenuto brutti risultati mentre con la takara ex taq va molto meglio..ma che differenze ci può essere con la taq gold?
Entrambe Taq-Gold e Takara Ex Taq sono modificazioni della Taq comune, solo che la Taq-Gold è semplicemente una hot-start, cioè è inattivata dal legame con un enzima e viene attivata al calore (durante la fase di denaturazione) quindi evita la formazione di prodotti aspecifici.
La Takara Ex Taq invece ha delle modificazioni che la rendono più efficiente e più sensibile (oltre ad avere anche attività di proof reading) è per questo che funziona meglio nella real time. Anche nella PCR end-point sarebbe più efficiente... ma non te ne accorgi mentre nella real time è più evidente.
FAQs - Ex Taq™ Polymerase
Inoltre in genere anche il buffer per real time può essere modificato per aumentare l'efficienza.
Ad es. io ho dovuto fare una real time per un caso particolare utilizzando un kit in cui c'era il buffer ma non la Taq ed ho utilizzato una Taq normalissima, ma comunque la real time era più efficiente rispetto a quella fatta utilizzando una mix apposita per real-time contenente già la Taq "apposta per Real-Time". 
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kiki
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2007 : 14:07:35
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Grazie mille x le dritte!quindi in pratica la Takara ha attività di correzione di bozze giusto?mentre la Gold no, per cui se sbaglia a inserire una base può tornare indietro e mettere la base giusta?
Secondo te che tipo di modificazioni può avere la Takara per renderla più specifica?ho letto che è High fidelity..secondo te cosa vuol dire?
Grazie ancora!! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2007 : 23:30:55
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Citazione:
Messaggio inserito da kiki
Grazie mille x le dritte!quindi in pratica la Takara ha attività di correzione di bozze giusto?mentre la Gold no, per cui se sbaglia a inserire una base può tornare indietro e mettere la base giusta?
Si esatto! Però non è questo il motivo per cui funziona meglio nella real time
Citazione:
Secondo te che tipo di modificazioni può avere la Takara per renderla più specifica?
Sinceramente non lo so! Ogni ditta fa le sue modifiche agli enzimi... ma ovviamente non dicono quali sono
Citazione:
ho letto che è High fidelity..secondo te cosa vuol dire?
"High fidelity" significa che ha una elevata "accuratezza" cioè incorpora i nucleotidi facendo "meno" errori rispetto alla Taq normale. Questo è importante ad es. quando devi sequenziale il prodotto di PCR oppure clonarlo. Ma nel caso in cui fai una real time non ti interessa in realtà l’accuratezza. Il fatto che una Taq abbia attività di proof reading ne aumenta l’accuratezza.
Per fare un riassunto i parametri importanti per una DNA Polimerasi sono:
- Specifity (specificità): amplificazione di prodotti “specifici” (diminuire della la presenza di prodotti aspecifici)
- Sensitivity (Sensibilità): amplificazione anche da poca quantità di campione
- Efficiency (Efficienza): produrre una maggiore quantità di prodotto
- Fidelity (Fedeltà): accuratezza nell’inserire i nucleotidi (minor tasso di errore)
- Processivity (Processività): quanto a lungo la polimerasi rimane attaccata allo stampo, quindi quanti nucleotidi di seguito riesce ad incorporare (lunghezza del prodotto che riesce a formare)
Nel caso della Real Time sono importanti Specificità, Sensibilità e casomai Efficienza.
La processività invece è importante se vuoi amplificare frammenti lunghi.
Spero siano chiariti tutti i dubbi
P.S. Bel nickname kiki da dove viene? Per caso da "kiki delivery service" ? |
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kiki
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2007 : 17:05:32
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Grazie mille!!!ah non riesco ad aprire il link pdf perchè mi dà errore e mi dice che il file è criptato.
kiki è solo un diminutivo del mio nome chiara
Grazie ancora!! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2007 : 18:02:28
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Citazione:
Messaggio inserito da kiki
non riesco ad aprire il link pdf perchè mi dà errore e mi dice che il file è criptato.
Strano a me si apre sia da casa che dal labo comunque te lo allego prova a vedere se così lo vedi:
Allegato:  Analisi di mutazioni puntiformi non note.pdf
207,39 KB
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Dhplc e real time pcr
Didattica e Relazioni
