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Discussione |
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ritis
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
 Inserito il - 05 ottobre 2007 : 17:33:49
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Ciao a tutti, mmm distrattamente, la mia testa a volte è altrove preparando una mix RT-PCR per ricerca di pestivirus anzichè mettere 4
ul di buffer 10X ne ho messo 0.04ul ....
Secondo voi ho speranze di qualche risultato?
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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zio
Utente Junior
Città: Napoli (IRAQ)
120 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2007 : 22:33:25
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Citazione:
Messaggio inserito da ritis
Ciao a tutti, mmm distrattamente, la mia testa a volte è altrove preparando una mix RT-PCR per ricerca di pestivirus anzichè mettere 4
ul di buffer 10X ne ho messo 0.04ul ....
Secondo voi ho speranze di qualche risultato?
 la speranza è sempre l'ultima...
 piuttosto mi interesserebbe sapere che tipo di pestivirus stai ricercando
a proposito, mi dici come hai fatto a prelevare 0.04ul
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zio |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2007 : 23:01:00
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Citazione:
Messaggio inserito da zio
a proposito, mi dici come hai fatto a prelevare 0.04ul
Beh io sono arrivata anche fino a 0.02 con una P2.5 (il limite sarebbe 0.01), lo so non è molto accurato!!!
Comunque magari può anche darsi che abbia preparato una mix per più campioni e 0.04 si quello che c'è poi suddividendo nelle varie provette! |
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zio
Utente Junior
Città: Napoli (IRAQ)
120 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2007 : 23:26:24
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Beh io sono arrivata anche fino a 0.02 con una P2.5 (il limite sarebbe 0.01), lo so non è molto accurato!!!
Comunque magari può anche darsi che abbia preparato una mix per più campioni e 0.04 si quello che c'è poi suddividendo nelle varie provette!
 buona la seconda? |
zio |
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Iris82
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2007 : 10:07:46
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| secondo me nn ne hai tante....da 4 a 0.04 è un po pochino.....cmq spera spera.... |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2007 : 15:27:10
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se stiamo parlando di RetroTrascrizione ed amplificazione per PCR classica, le speranze non sono poi tanto poche... la funzione del buffer è principalmente quella di settare il pH della soluzione con un tampone e poi aggiungere il magnesio fondamentale per l'attività di polimerizzazione.
Incredibilmente è più importante la presenza del magnesio piuttosto di quella del buffer poiché se lavori bene il pH finale della soluzione che fai è praticamente molto vicina a 7.4, e non ci dovrebbero essere tamponi per fermare il pH a quel valore, quindi basta un po' di buffer tamponato ed il pH si avvicinerà molto a quel valore di pH a cui funziona la tua Taq, ovvero funzionerà un po' male ma funziona.
Quindi se usi invece una soluzione di cloruro di magnesio a parte come capita a me allora le speranze non sono proprio prossime a 0, se hai lavorato bene.
Invece se il buffer che hai messo 1:100 comprende anche il cloruro di magnesio le speranze sono praticamente nulle. senza il magnesio i nucleotidi non possono polimerizzare ed i primers si attaccano con difficoltà al DNA stampo, oltre che l'attività dell'enzima è praticamente nulla.
La concentrazione finale del magnesio dovrebbe aggirarsi intorno a 1,5 mM, nel tuo caso sarebbe appena 12 nM da dividersi in 200 nM di ogni nucleotide. Ai primi 2-3 cicli tutto il magnesio sarà intrappolato con i fosfati che si liberano.
N.b.: se stai facendo una quantizzazione butta tutto prima di sperare in un miracolo... potrebbe solo confonderti le idee.
in bocca al lupo
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ritis
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2007 : 16:32:37
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I miracoli esistono 
PCR uscita, in effetti aveva ragione Neuroscience...il buffer nn comprendeva il cloruro di magnesio...
cmq nn era una quantizzazione dovevo determinare se il campione era positivo o meno...
grazie a tutti... |
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Bio
Nuovo Arrivato
55 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2007 : 20:09:42
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Ciao ritis, m spiace esser entrata tardi in discussione, avrei forse potuto essere d'aiuto. M piacerebbe sapere, se possibile, su che tipo di virus stai lavorando, io ho lavorato x un anno sul virus influ proprio cn l'RT-PCR... sn curiosa!  |
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ritis
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2007 : 21:13:33
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| Ciao Bio, si tratta di accertamenti diagnostici, e dipende dalla richiesta pestivirus, coronavirus...tu influenza aviaria? |
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RT-PCR
Didattica
