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nanà
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 Inserito il - 05 ottobre 2007 : 21:23:13
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Salve a tutti...volevo chiedervi se qualcuno aveva un protocollo dettagliato del gst-pulldown e chiedere consiglio per la purificazione della proteina ricombinante xchè ho problemi nell'estrazione...vi ringrazio in anticipo....Nadia
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Luca-DNA
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Inserito il - 05 ottobre 2007 : 21:47:17
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Un protocollo dettagliato sul GST-pulldown non ce l'ho...so a grandi linee come si fa...non dovessere molto differente da una IP...
Per quanto riguarda la purificazione della proteina ricombinante GST chiedi pure...ne ho purificate tante...ehehe
Ciao
Luca |
A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin) |
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nanà
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Inserito il - 05 ottobre 2007 : 21:59:43
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| beh...nn potresti passarmi il tuo protocollo...io devo purificare la proteina ricombinante...e dal pellet di un litro di coltura batterica ne ricavo ahimè poca...credo mi finisca nei corpi d'inclusione...hai qualche consiglio x evitare che finisca lì? mi hanno consigliato l'induzione a 30 gradi...tu cosa ne pensi??? grazie mille... |
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Luca-DNA
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Inserito il - 05 ottobre 2007 : 22:10:24
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Sì...secondo me è meglio indurre i batteri...Io usavo x indurre IPTG 0,02mM (se come penso usi un costrutto pGEX) a 37°C per 3h e 30 min...
è un procedimento lunghissimo...però ottenevo una concentrazione di proteina sui 4 ug/ul...
A proposito, cosa usi per la purificazione?? Le colonnine o le beads Glutatione Sepharose 4B?? |
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nanà
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Inserito il - 05 ottobre 2007 : 22:27:44
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| purtroppo niente colonnine...solo beads...xò la resa è bassa...nn capisco dove mi finisca la proteina |
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Luca-DNA
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Inserito il - 05 ottobre 2007 : 22:31:08
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| ma quanta proteina riesci ad ottenere? Ovviamente le beads non sono efficienti come le colonnine...che sono pure costose...cmq anche io ho sempre usato le beads... |
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nanà
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Inserito il - 05 ottobre 2007 : 22:41:34
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| ma tipo quantizzandola con la curva di taratura della bsa esce fuori che da 1 litro di coltura...me ne ricavo alla fine 3 ml di proteina concentrata tipo 50 ng/Microlitro(ops nn so dove sta la m di micro:D) e soprattutto nn è purissima...vedo dei prodotti di degradazione...credi sia normale? |
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Luca-DNA
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Inserito il - 05 ottobre 2007 : 22:50:16
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come ti dicevo io ne ricavavo da 1-4 ug/ul ottenendo un volume di circa 2-3 ml...
ovviamente non sono molto pure e contengono prodotti di degradazione...quindi magari poi conviene dializzare...
cmq come eluisci le proteine dalle beads?? Penso l'elution buffer giusto, visto che ti serve taggata GST per fare il pull-down... |
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nanà
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Inserito il - 05 ottobre 2007 : 23:00:34
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| si si eluisco con elution buffer con il gsh x staccare...e dializzo anche over night è la seconda volta che lo faccio...forse devo fare più esperienza ed attenzione...quindi dici che di quantità ci siamo...nn se ne ricava tantissima...e x fare la preparativa da quanta coltura parti e quanta proteina utilizzi...sei gentilissimo cmq...ti ringrazio molto...poi di venersì sera...;) |
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Luca-DNA
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Inserito il - 05 ottobre 2007 : 23:11:15
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Non so se ho capito bene...
cmq "picko" una colonia dalla piastra e la metto a crescere in 200 ml di LB+Amp over night...il mattino seguente prelevo 20 ml di crescita e le metto in 1 litro di mezzo e le lascio crescere fino ad una OD(600) di 0,65-0,7...poi le induco con IPTG come ti avevo detto prima (o IPTG 0,02mM per 3h e mezza oppure IPTG 0,01mM per 6h a 30°C...è + lungo ma mi sembre che venisse meglio...)
Cosa intendi per quanta proteina utilizzi??
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nanà
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Inserito il - 05 ottobre 2007 : 23:15:22
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| mi riferisco al vero e proprio pulldown...quanta proteina usi x il binding con i lisati radioattivi???forse fai uso diverso della proteina fusa alla gst...nn so... |
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Luca-DNA
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Inserito il - 05 ottobre 2007 : 23:18:41
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infatti non ho mai fatto un pull-down...magari prova a vedere su qualche articolo quanto la usano oppure su internet se c'è qualche protocollo...
se è simile ad una IP io generalmente utilizzo 1-1,5 mg di proteina in estratto totale da cellule però...che pensandoci è una quantità enorme di proteina purificata...quindi fai come se nn ti avessi detto nulla...ehehe |
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nanà
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Inserito il - 05 ottobre 2007 : 23:22:31
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| ehehe...i miei dubbi restano...ma sei stato gentile...grazie...:) |
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Luca-DNA
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Inserito il - 05 ottobre 2007 : 23:26:54
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| figurati...è stato un piacere...buona serata!! |
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GST PULL DOWN
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